松花粉对甘油诱导大鼠急性肾衰竭的保护作用

朱晓娜，韩 琳

江苏省徐州市儿童医院药剂科,徐州 221000

松花粉对甘油诱导大鼠急性肾衰竭的保护作用

朱晓娜，韩 琳

江苏省徐州市儿童医院药剂科,徐州 221000

目的：研究松花粉对甘油诱发大鼠急性肾衰竭（acute renal failure，ARF）的保护作用及机制。方法：采用双侧后肢注射50%甘油溶液（10 mL·kg-1）诱发大鼠成急性肾衰竭模型，检测大鼠血清肌酐（Scr）、血清尿素氮（BUN）的含量，肾组织中超氧化物歧化酶（SOD）的活性，谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）的含量，同时测定肾组织中一氧化氮（NO）的含量和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的活性；HE染色观察肾病理组织形态学变化。结果：与空白组大鼠相比，模型组大鼠血清Scr和BUN的含量明显上升，肾组织中SOD的活性和GSH的含量显著降低，MDA的含量显著升高；组织病理检查发现，模型组大鼠肾小管损伤明显，肾皮质细胞部分脱落，肾小球肿胀，间质炎性侵润明显。给予松花粉治疗后，可显著降低ARF大鼠血清Scr和BUN，升高肾组织中SOD的活性、GSH的含量，降低MDA的含量，同时发现，松花粉可明显降低肾组织中NO的含量和iNOS的活性，并显著降低肾组织损伤。结论：松花粉对甘油致大鼠ARF具有治疗作用，其作用机制可能与抑制iNOS的活性，降低体内NO过多产生，降低NO相关的脂质过氧化过程有关。

松花粉；急性肾衰竭；一氧化氮；诱导型一氧化氮合酶；氧化应激

松花粉（pollen pini），药名松黄，其成分稳定、易被机体吸收利用，是一种营养价值高、作用广泛的中药保健品。现代药理研究发现[1-2]，松花粉具有抗氧化、抗炎、保护肝脏以及调节免疫系统和心血管系统等广泛作用。本实验以甘油诱发大鼠急性肾衰竭为模型，研究松花粉对肾脏的保护作用及其相关机制。

1 材料

1.1 药品和试剂

松花粉，由中国林科院松花粉开发研究中心提供，采用5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）配制成所需浓度的混悬液；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、总丙二醛（MDA）测试盒、谷胱甘肽（GSH）试剂盒、血清肌酐（Scr）测试盒、血清尿素氮（BUN）测试盒、一氧化氮（NO）测试盒、苏木素伊红（HE）染色试剂盒，均购置南京建成生物研究所；诱导性一氧化氮合酶（i-NOS）ELISA试剂盒购于上海西塘生物有限公司。

1.2 仪器

高速匀浆机（上海弗鲁克流体机械制造有限公司）；751G-可见紫外分光光度计（上海分析仪器厂）；IX71光学显微镜（日本奥林巴斯光学工业株式会社）等。

1.3 动物

健康雄性SD大鼠，体重180～230 g，徐州医学院动物实验中心，动物许可证编号：SYXK（苏）2010-0011。实验前自由饮食一周，适应环境，室温（23±2）℃，湿度50%±10%。

2 方 法

2.1 动物分组

将大鼠随机分为4组，分别为空白对照组、模型组、松花粉低剂量组（350 mg·kg-1）和松花粉高剂量组（700 mg·kg-1）；每组8只。

2.2 模型制备

开始实验时，禁水不禁食24 h后，除空白对照组大鼠外，其他3组大鼠一次性后肢注射50%甘油10 mL·kg-1体重，制备肾衰竭模型，此后所有大鼠给足水食。除空白组、模型组外，其他2个治疗组每天同一时间点分别给予松花粉350 mg·kg-1和700 mg· kg-1治疗，连续给药7 d。

2.3 样本采集及生化指标的测定

末次给药3 h后，各组大鼠麻醉处死，于腹主动脉取血，3000 r·min-1离心取血清，用于测定Scr和BUN的含量。取肾脏用于检测SOD活性、iNOS、GSH、MDA、NO的含量，严格按照试剂盒规定的方法比色测定吸光度，按公式换算成SOD、iNOS的活性以及GSH、MDA、Scr、BUN和NO的浓度。

2.4 苏木素-伊红染色观察肾组织的损伤

肾脏组织经4%多聚甲醛固定，乙醇脱水后用石蜡包埋，4 μm切片，HE染色，于显微镜下观察组织病理改变。

2.5 统计学处理

3 结 果

3.1 松花粉对大鼠血清Scr和BUN含量的影响

表1结果显示，与空白组比较，模型组血清肌酐和尿素氮显著升高；与模型组比较，松花粉低剂量组（350 mg·kg-1）和松花粉高剂量组（700 mg·kg-1）血清肌酐的含量明显降低，同时两给药组血清尿素氮的含量也明显降低。

3.2 松花粉对大鼠肾SOD的活性、GSH和MDA含量的影响

表1结果显示，与空白组比较，模型组大鼠肾组织SOD的活性和GSH含量明显降低，MDA含量明显升高；与模型组相比，松花粉高剂量组（700 mg· kg-1）肾组织SOD的活性和GSH明显提高，松花粉低剂量组 （350 mg·kg-1）GSH含量与模型组相比无显著差异，松花粉低剂量组和高剂量组肾MDA含量显著降低。

3.3 松花粉对大鼠肾iNOS活性和NO含量的影响

表1结果显示，与空白组比较，模型组大鼠肾组织iNOS的活性和NO的含量明显升高；与模型组相比，松花粉低剂量组（350 mg·kg-1）和松花粉高剂量组（700 mg·kg-1）肾组织中iNOS的活性和NO的含量显著降低。

表1 松花粉对大鼠Scr、BUN、SOD、GSH、MDA、iNOS和NO含量的影响（±s，n=8）

表1 松花粉对大鼠Scr、BUN、SOD、GSH、MDA、iNOS和NO含量的影响（±s，n=8）

注：与空白组比较，**P＜0．01；与模型组比较，#P＜0．05，##P＜0．01。

组别剂量/ mg·kg-1Scr/ mmol·L-1BUN/ mmol·L-1SOD/ kU·g-1GSH/ mmol·g-1MDA/ mmol·g-1iNOS/ nmol·min-1·g-1NO/ μg·g-1空白组—26．12±2．33 9．69±0．65 193．56±1．36 6．83±0．14 0．85±0．18 0．47±0．06 9．83±0．15模型组—48．43±2．73**32．4±3．42**103．17±4．41**2．65±0．39**3．73±0．16**4．37±0．22**24．65±0．39**松花粉低剂量组350 34．22±2．11#24．82±3．32#146．47±3．72#3．21±0．36 2．35±0．23#1．78±0．23#16．23±0．42#松花粉高剂量组700 27．00±2．01##16．50±2．43##156．35±5．64##5．57±0．76#1．03±0．14##1．39±0．15##12．52±0．16##

3.4 HE染色

光镜检查发现，空白对照组大鼠肾组织结构正常，肾小管上皮细胞完整，肾小球及肾间质未见明显病理改变（图1A）；模型组肾小管管腔明显扩张，上皮细胞刷状缘消失，大量上皮细胞水肿、空泡变性、坏死，间质炎性浸润（图1B）；松花粉高剂量组肾小球体积基本正常，肾皮质细胞排列较整齐（图1C）。

4 讨 论

研究报道[3]，甘油诱导的急性肾衰竭动物中，都伴有机体内部氧自由基水平升高、还原性酶活性降低的现象，同时大量氧自由基的产生与肾组织细胞大分子反应，导致脂质过氧化，进而破坏肾组织细胞的膜结构，破坏肾脏的正常生理功能[4-5]。

研究发现[6]，在急性肾衰竭病理状态下，肾组织中NO的生成和释放显著增加。NO是由以L-精氨酸为底物在NOS的催化下生成的一种重要气体信号小分子物质。正常生理功能下，NO在肾脏的内部血液和体液以及钠钾平衡中发挥重要作用；但NO的过量生成释放与肾小管的损伤密切相关，破坏细胞蛋白和呼吸链，且一氧化氮过量产生的过氧亚硝酸根离子直接参与细胞内部的脂质过氧化反应。Rubanyi等[7]研究发现，急性肾衰竭中，NO的生成释放增加的同时，iNOS的表达也显著上升，说明iNOS及NO与肾组织急性衰竭的密切关系。

有文献报道[8]，松花粉对D-半乳糖诱导的亚急性衰老动物的肾组织损伤具有显著的治疗作用，且其疗效与其抗炎、抗氧化等机制有关。本研究发现，松花粉高、低两个剂量组可明显降低甘油诱导的大鼠急性肾衰竭中血清肌酐和尿素氮的含量，说明松花粉对甘油诱导的大鼠急性肾衰竭具有改善作用。松花粉组与模型组比较SOD的活性明显升高，GSH的含量显著升高，MDA的含量明显降低，且松花粉给药剂量对氧化应激性肾损伤的保护作用呈现一定的量效关系，同时进一步研究发现，给予松花粉可显著降低大鼠肾组织中iNOS的活性和NO的含量，组织形态学观察发现，松花粉可明显降低肾脏的损伤程度，保护肾小管和肾小球的正常生理功能，降低炎性侵润，显示其对急性和亚急性肾脏疾病存在较为有效的治疗作用和潜在的药用价值。

图1 松花粉对肾组织的保护作用

综上所述，松花粉对甘油诱导的大鼠急性肾衰竭具有保护作用，其作用机制可能与松花粉抑制肾组织中iNOS的活性，降低一氧化氮含量，降低肾组织氧化应激损伤，维持组织细胞正常生理功能有关。本实验研究为临床治疗急性肾衰竭提供一定的理论依据。

[1]立 新，喻 陆．松花粉抗衰老作用的实验研究[J].现代医学，2004，32（2）：74-6.

[2]Lee KH,Kim AJ,Choi EM.Antioxidant and antiin-flammatory activity of pine pollen extract in vitro[J]. Phytother Res,2009,23(1):41-48.

[3]Chander V,Chopra K.Molsidomine,a nitric oxide donor and L-arginine protects against rhabdomyolysisinduced myoglobinuric acute renal failure[J].Biochim Biophys Acta,2005,1723:208-14.

[4]Mahieu S,Contini Mdel C,Gonzalez M，et al.Mela-tonin reduces oxidative damage induced by aluminium in rat kidney[J].Toxicol Leu,2009,190(1):9-15．

[5]Muraoka S.Miura T.Free radicals mediate cardiac toxicity induced by adriamycin[J].Yakugaku Zasshi, 2003,123(10):855-66．

[6]Valdivielso JM,Blantz RC.Acute renal failure:is ni-tricoxide the bad guy?[J].Antioxid Redox Signal,2002, 4(6):925-34.

[7]Rubanyi GM,Vanhoutte PM.Superoxide anions and hyperoxia inactivate endothelium-derived relaxing factor [J].Am J Physiol,1986,250(5 Pt 2):H822-7.

[8]李 斌，喻 陆，高德禄，等.松花粉对亚急性衰老小鼠模型肾功能的影响 [J].浙江临床医学，2009，11（11）：1129-31.

Protective Effects of Pollen Pini against Glycerol-induced Acute Renal Failure in Rats

ZHU Xiao-na,HAN Lin
Department of Pharmacy,Xuzhou Children’s Hospital of Jiangsu Province,Xuzhou 221000

Objective:To study the protective effect of pollen pini against acute renal failure(ARF) induced by glycerol and its underlying mechanisms in rats.Methods:The rats were intramuscularly injected with 50%glycerol (10 mL·kg-1)in each hind leg to establish kidney damage.After the pini treatment for seven days,the contents of serum creatinine (Scr)and urea nitrogen (BUN),the activities of superoxide dismutase (SOD),inducible nitric oxide synthase (iNOS)and the contents of glutathione(GSH), malondialdehyde (MDA)and NO in the kidney tissue were examined.Results:Compared the model group with the control group,the contents of Scr and BUN in serum,the contents of MDA and NO and the activities of iNOS in kidney tissue were increased,the activities of SOD and the content of GSH were decreased;and the sections showed that the kidney tissue damage was obvious with bigger glomerular volume,swelling and degeneration of endothelial cells and renal interstitial inflammatory cell infiltration. However,pollen pini dose-dependently exhibited significantly decreases contents of Scr and BUN in the plasma,reduced contents of MDA and NO,and decreased activities of iNOS in the kidney tissue,as well as increased activities of SOD and content of GSH in the kidney tissue.The damage decreased after the administration of pollen pini.Conclusion:The results indicated that pollen pini had a protective effect against glycerol-induced ARF in rats.It is considered that this protective effect may be related to its activities on inhibition of iNOS and the level of NO,and its free radical scavenging related to NO.

Pollen pini;Acute renal failure(ARF);NO;iNOS;Oxidative stress

R965.1

A

1673-7806（2015）03-232-03

朱晓娜，女，主管药师 E-mail:zhuxn2014@163.com

*通讯作者韩琳，女，副主任药师 E-mail:dollhl@126.com

2014-10-06

2015-03-26