硝基四氮唑蓝法测定糖化血清蛋白的影响因素分析及对策＊

彭秀娟，马永能，杨星悦，刘 姗，何 芳，刘国雄

（四川省绵阳市第三人民医院检验科，四川绵阳621000）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）作为危害人类健康的重要疾病之一，其患病率逐年上升，预计至2030年将达4.39 亿人［1-2］。早在2010年，糖化血红蛋白（glycosylated hemoglobin，GHb）被美国糖尿病协会推荐作为DM 患者血糖控制监测、筛查和诊断糖尿病的常用实验指标［3］，但GHb的检测需要特殊的仪器，费用昂贵，在我国还未能普及。而常用的四氮唑蓝比色法（NBT）测定糖化血清蛋白（glycosylated serum protein，GSP）可以弥补价钱昂贵的缺点，是目前临床诊断DM或监测血糖控制的常用指标［4］。GSP是血液中的葡萄糖（glucose，Glu）与血清蛋白分子发生的非酶促糖化反应的产物，由于清蛋白的半衰期大约为17～21d，故GSP 水平可有效反映患者过去2～3周内的平均葡萄糖水平，是检测DM 患者血糖控制非常适宜的指标［5-6］。在实际工作中常发现GSP 在低清蛋白（albumin，Alb）血中降低而在高胆红素血中升高的现象，这使得医生不能准确判断患者体内的血糖水平，患者得不到及时治疗，增加了医疗风险。本文拟对低Alb血和高胆红素血对GSP测定影响作一评估，以便临床医生正确评估患者的病情。虽然GHb中的HbA1c的测定易受血红蛋白其他（如HbAo等）成分的干扰［7］，但不受饮食、低蛋白和黄疸等影响因素的干扰，故在本研究中，采用HbA1c的测定结果作为评估血糖浓度的“金标准”。

1 资料与方法

1.1 一般资料 正常对照组选择2013年9月本院体检职工80例，所有的受试者均无基础疾病，要求清晨抽空腹血3～5 mL，且血清Alb正常（40.0～60.0g／L）、总胆红素（total bilirubin，TBIL）测定值正常（5.1～19.0μmol／L）；同时要求空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）正常（3.9～6.11mmol／L）。低Alb和高胆红素试验组选取2013年7～12月本院住院或门诊的患者。低Alb试验选取临床已经确证的DM 患者159例，其中Alb正常的单纯糖尿病（DM）患者83例（DM 组），清蛋白（Alb＜40.0g／L）降低的糖尿病肾病（DN）患者76例（DN 组）；高胆红素组选择TBIL 增高大于55.0μmol／L 而Alb和Glu正常的患者186例。

1.2 仪器 贝克曼AU2700全自动生化分析仪、Bio-Rad D-10糖化血红蛋白仪

1.3 方法 GSP采用NBT 法，试剂由浙江宁波美康生物科技股份有限公司提供，正常参考范围为1.00～2.14mmol／L；Alb测定采用溴甲酚绿（BCG）法，正常参考范围为40.0～60.0 g／L；血糖测定采用己糖激酶（HK）法，正常参考范围为3.90～6.11mmol／L；TBIL测定采用钒酸盐氧化（VO）法，正常参考范围5.1～19.0μmol／L，试剂均由上海科华生物工程股份有限公司提供。TBIL、Alb、血糖和GSP的测定采集受试者肘静脉血3～5 mL，4 000r／min，离 心5 min，取 上 层 血 清 用AU2700全自动生化分析仪进行测定，对各组结果进行比较分析；HbA1c的检测于采集受试者肘静脉血3mL采用高效液相色谱法（Bio-Rad D-10 HbA1c仪）进行检测，实验所用试剂是仪器配套试剂，性能稳定，并严格按说明书操作，正常参考范围为4.0%～6.5%。

1.4 统计学处理 采用SPSS16.0软件进行统计分析，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，计数资料采用χ2检验，检验水准α＝0.05。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 低Alb 血中GSP 结果降低 经方差 分 析DM、DN 组Glu、Alb、GSP与正常对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.01）；经t检验分析DM 组GSP 明显高于正常对照组（P＜0.01），而DN 患者组GSP明显低于正常对照组且低于DM 组（P＜0.01）。各组GSP的检测结果见表1，图1。

表1 DN 组与正常对照组及DM 组GLU、 Alb及GSP的检测结果（±s）

表1 DN 组与正常对照组及DM 组GLU、 Alb及GSP的检测结果（±s）

组别 n Glu（mmol／L） Alb（g／L） GSP（mmol／L）正常对照组80 4.68±0.64 44.1±4.2 1.37±0.09 DM 组 83 11.36±3.62 40.17±5.6 2.67±0.37 DN 组76 13.94±3.17 31.7±4.2 1.12±0.23

图1 DN 组、正常对照组及DM 组GSP的检测结果

2.2 血清Alb降低时，Glu与GSP无相关性 直线相关分析表明，在正常对照组中，Alb水平正常时，Glu与GSP成正相关（r2＝0.389，P＜0.01），而当Alb水平明显降低（DN 组）时，Glu与GSP无相关性（P＞0.05）。

2.3 高胆红素血使GSP测定值增高 TBIL 测定采用钒酸盐氧化法，试剂本身有一定的抗胆红素干扰能力，按照厂家提供的说明表示，血标本中TBIL 含量小于5 mg／dL（大约83.3 μmol／L）采用本方法对GSP 的测定没有影响，但在实际工作中，结合临床诊断和GHb结果分析发现，TBIL＞55.0μmol／L即有可能对GSP 的测定造成影响，故本研究采用血标本中TBIL＞55.0μmol／L为高胆红素血。采用直线相关分析发现，GSP的水平与TBIL呈正相关（r2＝0.434，P＜0.01）。见图2。

图2 高胆红素血对GSP测定的影响

表2 DN 组GSP和HbA1c的检测结果（n）

表3 高胆红素组GSP和HbA1c的检测结果（n）

2.4 血Alb降低或TBIL升高时，需测定GHb反映患者平均血糖水平 为了更清楚地说明低清蛋白血和高胆红素血对GSP测定的影响，本研究同时用高效液相色谱法测定了DN 组和高胆红素组试验者的HbA1c。HbA1c 正常参考范围为4.0%～6.5%，将大于6.5%定义为阳性，小于6.5%定义为阴性；GSP正常参考范围为1.00～2.14mmol／L，将大于2.14定义为阳性，小于2.14定义为阴性，应用四格表χ2检验（表2和表3）对GSP和GHb两种方法评价血糖控制做相应评价，表2为DN 组GSP和HbA1c的检测结果，发现HbA1c测定阳性的患者55（72.3%）例，GSP测定阳性的患者7（9.2%）例（χ2＝46.08，P＜0.05）；表3为高胆红素组GSP和HbA1c的检测结果，发现HbA1c测定阴性的患者是180（96.7%）例，GSP测定阴性的患者是54（29.0%）例（χ2＝122.1，P＜0.05）。结果表明，两种测定方法差异有统计学意义，即当血清蛋白降低或总胆红素升高时，采用高效液相色谱法测GHb 较NBT 法测GSP更能反映患者真实的平均血糖水平，为医生提供更为有用的实验室参考。

3 讨 论

内源性或者外源性物质的干扰是影响实验室检测结果，造成错误测定和误判的主要原因之一。大量的研究表明，主要的内源性物质包括M 蛋白、自身抗体、胆红素、脂肪和血红蛋白［8-11］。而Steen等［12］的研究表明严重的黄疸、脂血及溶血等标本，对实验结果有显著的影响。在比色法中改变了色度，或多或少会影响测定结果的准确性。对于全自动生化分析仪，目前通过设定双试剂、双波长等来减少或者消除实验方法或者干扰物对测定结果的影响，但是对个别项目来说，其影响仍很严重，影响了临床医生对疾病的诊断和判断。为了降低医疗风险，为临床医生提供符合患者病情的准确的检验结果，越来越多的研究者致力于这些干扰物对测定结果影响的研究，期望能消除干扰带来的影响。李文郎等［13］在健康人血清中加入不同浓度的胆红素来评估其对GSP 测定的影响，发现胆红素浓度越高，GSP假性升高得越多。而清蛋白对GSP 测定结果的影响也越来越被重视［14］。在日常工作中，作者发现高胆红素和低Alb对GSP的测定结果影响非常严重，从表1和图1可以看出在血糖正常的正常对照组GSP的水平为1.28～1.46g／L（平均值为1.37g／L）；而在Alb降低的DN 患者中GSP 明显降低，其GSP均值与正常对照组和DM 组有明显的差异；而此时的血糖水平均值（13.94±3.17）mmol／L，明显高于正常对照组的（4.68±0.64）mmol／L 和DM 组 的（11.36±3.62）mmol／L。直线相关分析表明，在健康人中，Alb水平在正常范围波动时，Glu与GSP 成正相关（r2＝0.389，P＜0.01），而在Alb浓度明显降低的DN 组，Glu 与GSP 不在具有相关性（r2＝0.161～0.203，P＞0.05）。由此可见，血清清蛋白降低时，采用NBT 法测定GSP已不能反映患者体内2～3周血糖的平均水平。

另一组高胆红素血的实验表明，当血清TBIL 升高，GSP假性升高。当TBIL 高于55.0μmol／L 时，GSP 明显升 高，而且随着TBIL水平的升高，GSP的测定值也相应增高。作者采用直线相关分析发现，GSP 的水平与TBIL 呈直线正相关（r2＝0.434，P＜0.01）。

为了更清楚地说明低Alb血和高胆红素血对GSP测定的影响，本研究同时测定了低Alb DN 组和高胆红素组试验者的HbA1c。同时将低于和高于HbA1c和GSP 正常参考范围相应的设定为阴性和阳性建立四格表，发现在DN 组，HbA1c阳性的55例，其中HbA1c单独阳性的49例（89.09%）；而在血糖正常的高胆红素组，HbA1c阴性的180 例，其中HbA1c单独阴性的128 例（71.11%），两个试验均说明当Alb 降低或TBIL升高时，与GSP 测定相比，GHb中HbA1c测定更能准确反映患者的真实血糖水平，对患者体内的血糖控制和治疗监测更有意义。上述试验结果表明，当清蛋白低于40.0g／L 或者TBIL高于55.0μmol／L时，用NBT 法测定GSP也不能作为判断患者短期（2～3周）体内血糖的平均水平，需要结合临床和采用GHb来综合评估。

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