两种检测试剂盒对猪瘟抗体水平检测结果的比较

李　丽，徐　璐，王　琴，李金海，邓　飞，周莉媛，陈弟诗，张　毅，张　睿（.四川省动物疫病预防控制中心，四川成都6004；.中国兽医药品监察所，北京海淀0008）

两种检测试剂盒对猪瘟抗体水平检测结果的比较

李丽1，徐璐2，王琴2，李金海1，邓飞1，周莉媛1，陈弟诗1，张毅1，张睿1
（1.四川省动物疫病预防控制中心，四川成都610041；2.中国兽医药品监察所，北京海淀100081）

摘要：选择一种由中国兽医药品监察所研制的国产试剂盒与美国IDEXX公司的进口试剂盒对300份猪血清同时进行检测，结果显示，两种试剂盒的符合率为83.67%；国产试剂盒检出的阳性率高于进口试剂盒；对检测结果不一致的49份血清用荧光抗体病毒中和试验（FVNT）进行了复核，国产试剂盒与FVNT的符合率为63.2%，进口试剂盒与FVNT的符合率为31.6%。试验结果表明，国产试剂盒具有更高的敏感性，能满足我国猪瘟抗体监测的需要。

关键词：猪瘟抗体；ELISA检测试剂盒；FVNT；符合率

猪瘟是困扰我国养猪业的最主要的疫病之一，由于疫苗的广泛使用，猪瘟流行形式由过去大面积的高发多发变为局部的温和型的散发。猪瘟抗体检测是疫苗免疫效果评价主要方法，而ELISA检测方法又以其操作简便、方法敏感、检测样本量大等优点成为猪瘟抗体检测的主要手段。目前，市场上检测猪瘟抗体的ELISA试剂盒繁多，主要以进口试剂盒为主。由于进口试剂盒价格昂贵，给基层抗体普查工作造成很大的经济负担，因此我们选择一种国产化猪瘟抗体检测试剂盒，与进口试剂盒同时对同一批血清样本进行检测，并采用猪瘟抗体检测的“金标准”-荧光抗体病毒中和试验对检测结果有分歧的血清进行定性复核检测，通过对检测结果的分析，旨在为筛选更适合我国实际需要的猪瘟抗体检测试剂盒提供更多的数据支持。

1　材料与方法

1.1PK15传代细胞系、猪瘟病毒T株、猪瘟病毒荧光抗体：系由中国兽医药品监察所鉴定、保存并提供。

1.2ELISA试剂盒猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒（简称国产试剂盒）：由中国兽医药品监察所提供。批号为20121110。

猪瘟抗体ELISA检测试剂盒（简称进口试剂盒），购自美国IDEXX公司，批号为A651。

1.3临床猪血清采自四川省境内。其中，商品猪场采集猪瘟疫苗免疫猪血清100份；种猪场采集二免或三免种猪血清140份；四川偏远地区采集散养户的非免疫仔猪血清60份。共计300份。

1.4ELISA试剂盒检测用国产试剂盒和进口试剂盒同时检测待检猪血清，操作方法均严格按照试剂盒说明书进行，每份血清重复2孔。

1.5荧光抗体病毒中和试验（FVNT）将上述两种ELISA试剂盒检测结果不符合的血清用FVNT进行符合验证。具体操作方法按照《陆生动物诊断试验和疫苗手册》[1]进行。

2　结果

2.1两种试剂盒的检测结果及符合率在300份血清中，国产试剂盒检测出猪瘟抗体阳性血清199份，阴性血清78份，可疑23份；进口试剂盒检测出猪瘟抗体阳性血清184份，阴性血清106份，可疑10份。两者的符合率为83.67%（符合率= （176+75）/300×100%=83.67%），见表1。

表1　国产试剂盒与进口试剂盒符合率

2.2两种试剂盒对不同来源猪血清的检测结果在临床采集的猪血清中，有采自商品猪场和种猪场的免疫血清共计240份，散养户采集的非免疫猪血清60份。在240份免疫血清中，国产试剂盒与进口试剂盒的符合率为80.8%（符合率= （170+24）/240×100%=80.8%），两者对阳性血清检测的结果差异较大。国产试剂盒检测出阳性血清193份，占免疫血清总数的80.4%；进口试剂盒检测出阳性血清156份，占免疫血清总数的65%。结果见表2。在60份非免疫血清中，两种试剂盒的符合率为95%（符合率=（6+51）/60× 100%=95%），均检测出6份阳性，国产试剂盒检测出51份阴性，3份可疑，阴性率为85%；进口试剂盒检测出54份阴性，阴性率为90%，见表3。

表2　两种试剂盒对免疫血清检测结果统计

表3　两种试剂盒对非免疫血清检测结果统计

2.3FVNT验证试验结果两种试剂盒检测结果差异的血清共计49份，采用荧光抗体病毒中和试验（FVNT）对有异议的血清进行检测，结果是阳性22份，阴性19份，可疑8份。国产试剂盒的检测结果是阳性23份，阴性3份，可疑23份，与FVNT的符合率为63.3%（符合率=（21+2+8）/49×100%= 63.3%）；进口试剂盒检测出阳性8份，阴性31份，可疑10份，与FVNT的符合率为32.7%（符合率（1+13+2）/49×100%=32.7%）。两种试剂盒与FVNT符合率见表4、表5。

表4　国产试剂盒与FVNT符合率

表5　进口试剂盒与FVNT符合率

3　讨论

3.1猪瘟抗体检测方法目前，国际上推荐的猪瘟抗体检测方法有过氧化物酶中和试验（NPLA）、荧光抗体病毒中和试验（FVNT）和ELISA检测方法[1]。其中NPLA和FVNT采用的原理相近，需将血清与一定量的病毒孵育后接种敏感细胞，检测的是中和抗体，二者被认为是检测猪瘟抗体的“金标准”。这两种检测方法对实验室条件及操作人员要求很高，并且耗时长（至少3 d），因此，不适合进行大量样本的检测。除了NPLA、FVNT这两种以外，我国使用的体外检测猪瘟抗体的方法还有正向间接血凝（IHA）、免疫金标快速检测技术、琼脂扩散试验（AGP）、抗体芯片技术等[2]。其中IHA依据肉眼判断结果，易受主观因素影响；免疫金标检测只能做定性判断并且在大量检测样本时不及ELISA方便；琼扩试验虽操作简单但敏感性差；抗体芯片技术的自动化检测结果可靠但仪器设备要求很高，不适合基层；而ELISA方法则以更为简便，易操作，检测样本量大，敏感性高，特异性好等优势更适合田间的大范围推广应用。

3.2ELISA试剂盒的研发原理基于不同的研发原理，不同的试剂盒在特异性和敏感性上可能会有所差异。目前，较为常用的ELISA试剂盒为进口的阻断ELISA试剂盒。该试剂盒采用阻断ELI⁃SA原理，以猪瘟病毒主要结构蛋白进行包被，将待检血清加入后进行孵育反应，特异性抗体能够将特定的表位进行结合封闭，当再加入辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体后，所呈现的颜色反应与特异性抗体含量成反比。由于在该种方法中使用的是特异性的单克隆抗体，因此该方法检测的阳性抗体为针对单一表位的抗体，所以有更好的特异性。本试验中选用的国产试剂盒是采用间接ELISA原理，同样以猪瘟病毒结构蛋白作为包被抗原，将待检血清加入后进行孵育反应，然后加入酶标二抗进行显色，所呈现的颜色反应亦与特异性抗体含量成正比[3]。间接ELISA方法检测对象为针对包被蛋白所有的阳性抗体，因此，该方法有更好的敏感性。

我们采用两种试剂盒共同对300份血清样本进行了检测，结果两者的符合率为83.67%。通过对血清的免疫背景进行分析后发现，国产试剂盒检测免疫血清的阳性率高出进口试剂盒15个百分点，说明国产试剂盒较进口试剂盒有更高的敏感性。在对非免疫血清的检测结果中，进口试剂盒较国产试剂盒阴性率高出5个百分点，因此说明进口试剂盒较国产试剂盒有更高的特异性。这一结果正是由于两种试剂盒的研发原理不同而造成的。

3.3两种试剂盒与“金标准”的符合率在检测的300份血清中，两种试剂盒检测结果有差异的血清共计49份，将49份血清进行FVNT定性检测。结果国产试剂盒与FVNT的符合率高出进口试剂盒30个百分点，因此说明，国产试剂盒较进口试剂盒更接近“金标准”的检测结果，所得到的结果更为准确。

3.4国产试剂盒更适合我国的抗体监测工作在本研究中，国产试剂盒检测免疫血清的阳性率为80.4%，而进口试剂盒仅为65%。在农业部每年发布的《国家动物疫病监测计划》中，要求免疫猪群阳性率≥70%才能能判为群体免疫合格。按照这一标准，采用国产试剂盒进行检测，则该群体为免疫合格群；若采用进口试剂盒进行检测，则该群体为不合格群。因此，在进行猪瘟抗体监测时，要慎重选择检测试剂盒，否则会对免疫效果的评价造成很大影响。本研究所采用的国产试剂盒的敏感性高，虽然在特异性上稍逊于进口试剂盒[4]，但根据国产试剂盒的说明，检测结果可疑血清可被判定为阴性。如按照这一标准，两种试剂盒的特异性相当。因此我们认为，国产试剂盒具有良好的敏感性与特异性，操作简便，质量可靠，更适合在我国的抗体监测工作。

参考文献：

[1]世界动物卫生组织.陆生动物诊断试验和疫苗手册（哺乳动物、禽鸟与蜜蜂）[M].农业部畜牧兽医局/中国动物卫生与流行病学中心，译.5版.2004．

[2]李振.猪瘟实验室抗体检测技术[J].当代畜牧，2012，2：17-18.

[3] John R . Crowther，the ELISA guide book[M] . 2001：Humana Press.

[4]徐璐，范学政，徐和敏.猪瘟抗体间接ELISA检测试剂盒方法的建立研制和应用优化[J].中国兽医杂志，2012，48（9）：21-24.

通讯作者：徐璐，E-mail：421203912@qq.com

作者简介：李丽（1985-），女，兽医师，硕士，从事动物疫病防控工作，E-mail：365087955@qq.com

收稿日期：2014-05-15

中图分类号：S858.28

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2015）10- 0080- 03