菌毒清口服液治疗人工感染鸡传染性鼻炎试验

牛建荣，张继瑜，周绪正，李剑勇，李　冰，魏小娟，杨亚军，刘希望（中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所农业部兽用药物创制重点实验室甘肃省新兽药工程重点实验室，甘肃兰州730050）

菌毒清口服液治疗人工感染鸡传染性鼻炎试验

牛建荣，张继瑜，周绪正，李剑勇，李冰，魏小娟，杨亚军，刘希望
（中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所农业部兽用药物创制重点实验室甘肃省新兽药工程重点实验室，甘肃兰州730050）

摘要：为了观察“菌毒清”口服液对人工感染鸡传染性鼻炎的治疗效果与现有的治疗鸡呼吸道疾病的中药“瘟毒清”口服液疗效进行比较。试验分为7组，包括2.0%、1.5%、1.0%和0.5%“菌毒清”饮水治疗组，1.0%“瘟毒清”饮水治疗组，阳性空白对照组和阴性空白对照组，鸡只自由饮用，连用7 d为1疗程。经1个疗程的治疗，“菌毒清”治疗组的治愈率分别为69.23%、77.78%、81.48%和62.96%，“瘟毒清”组的治愈率为78.57%；“菌毒清”治疗组的有效率分别为88.46%、88.80%、94.81%和81.48%，“瘟毒清”治疗组的有效率为89.29%；不同剂量“菌毒清”治疗组的有效率与“瘟毒清”治疗组差异不显著，但不同药物治疗组与阳性空白对照组差异显著（P<0.05）。表明“菌毒清”是治疗鸡传染性鼻炎的有效药物之一。

关键词：“菌毒清”口服液；鸡传染性鼻炎；疗效

鸡传染性鼻炎（Infectious coryza，IC）是由副鸡嗜血杆菌（Haemophilus gallinarum，HPg）所引起鸡的急性呼吸系统疾病。本病发生于各种年龄的鸡，老龄鸡感染较为严重。主要症状为鼻腔与鼻窦发炎，流鼻涕，脸部肿胀和打喷嚏。

育成鸡感染传染性鼻炎，生长迟缓，死亡率上升；产蛋鸡感染后，常引起产蛋率下降，而在产蛋高峰期或高峰期以后的鸡群感染传染性鼻炎，产蛋量可下降70%。

课题组根据养鸡业生产需要，筛选出治疗鸡呼吸道传染性疾病的复方中药制剂“菌毒清”口服液。该制剂根据传统中兽医学理论，以板蓝根、黄连、黄芩等组方，运用现代制药技术，精制而成。本试验的目的在于观察“菌毒清”对人工感染鸡传染性鼻炎的治愈率、有效率。并与阳性对照药物“瘟毒清”口服液进行比较，统计分析各组间的差异性，评价“菌毒清”治疗鸡传染性鼻炎的药效。

1　材料

副鸡嗜血杆菌（HPg）：北京标准株A型，购自中国兽医药品监察所。用于人工感染细菌。“菌毒清”口服液：用于治疗人工感染鸡传染性鼻炎患鸡。由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所研制。规格为每1 mL含生药1 g。批号：20130311。“瘟毒清”口服液对照药物，用于治疗人工感染鸡传染性鼻炎患鸡。由天津市挑战生物技术有限公司提供[兽药字（2006）020115030]。浓度为每1 mL含生药1 g。鸡胚100枚，用于测定副鸡嗜血杆菌鸡胚半数致死量（ELD50）和鸡胚传代培养。自己孵化的7日龄非免疫鸡胚。试验鸡为三黄鸡，350只，70日龄未免疫，经临床观察均为健康。购自兰州市榆中养鸡场。用于测定鸡半数感染量（ID50）；人工感染鸡传染性鼻炎患鸡模型。

2　方法

2.1副鸡嗜血杆菌（HPg）的培养

2.1.1种子液的培育将副鸡嗜血杆菌北京标准株A型培养液进行5倍稀释，作为原液,划线培养于鸡肉汤琼脂平板上，置37℃含5%～10% CO2（体积分数，下同）的培养箱中培养16 h～18 h，在斜射光线的显微镜下观察,选择荧光强的典型菌落接种于鸡肉汤中,同样条件下培养18 h～20 h。用鸡肉汤琼脂平板进行杂菌检验,无杂菌而生长出典型HPg菌落者即为种子液。

2.1.2鸡胚接种与收获取繁殖好的HPg种子液,接种7日龄鸡胚卵黄囊，0.2 mL/胚。置37℃条件下继续孵化，观察124 h，死亡的鸡胚分别收取卵黄、尿囊液及绒毛膜，研磨离心，取上清液。用鸡肉汤琼脂平板进行杂菌检验,生长出典型HPg菌落且无杂菌的留用[1]。

2.1.3细菌计数细菌计数按农业部颁发的《兽医微生物制品规程》进行，以10-1，10-2，10-3……10-6稀释，然后取0.1 mL稀释液均匀地涂抹在鸡肉汤琼脂平板上,每个稀释度做2板,置于37℃含5%～10% CO2的培养箱中培养18 h～20 h，2板的平均数即为该稀释度的细菌数。

2.2鸡胚半数致死量（ELD50）测定取死亡鸡胚的卵黄、尿囊液及绒毛膜的离心上清液，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的梯度稀释后接种鸡胚。采用FT-K数字智能化孵化机。所用SPF鸡胚为自行孵化，取7日龄鸡胚50枚。每个鸡胚分别接毒100、10-1、10-2、10-3、10-4梯度的稀释液0.2 mL，每个稀释梯度用10枚鸡胚37℃，56%相对湿度下孵化，3 h翻蛋1次。弃去48 h内死亡鸡胚，观察124 h，详细记录死亡与存活数。无菌收集72 h～148 h死亡鸡胚，3 500 r/min离心，取上清液，-20℃保存待用。按Reed-Menuch氏法计算HPg鸡胚半数致死量（ELD50）。

2.3HPg的鸡半数感染量ID50试验鸡为70日龄的未免疫的肉用三黄鸡50只，初试体重1.69～2.27 kg，每个试验组15只（分为3组）。将鸡保定好，找到气管，在气管内注射HPg上清液稀释液1.0 mL。测定其对鸡的半数感染量（ID50）。另5只为健康对照组，不做任何处理。连续观察14 d。按Reed-Menuch氏法计算HPg鸡半数感染量（ID50）。

2.4“菌毒清”治疗试验依据农业部1992年《实验临床试验技术规范》进行“菌毒清”治疗试验。

2.4.1分组70日龄未免疫的三黄鸡300只，经临床检查均为健康。分为“菌毒清”4组（2.0%、1.5%、1.0%和0.5%）、“瘟毒清”治疗组、阳性对照组及阴性（空白）对照组。见表1。

表1　试验动物分组与用药

2.4.2攻毒除健康对照组外，按照鸡半数感染量（ID50），用制备的HPg感染用稀释液（10- 1稀释），每只鸡气管内滴注射1.0 mL。

2.4.3治疗在鸡出现较典型的临床症状后（48 h）开始用药，各组按试验设计准确用药，将“菌毒清”按2.0%、1.5%、1.0%和0.5%的浓度分别加入饮水中，供相应组病鸡不限量自由饮用；以相同方法将“瘟毒清”按1.0%浓度分别加入饮水中，供药物对照组病鸡自由饮用，亦不限量。连续用药7 d 为1疗程。阳性对照组致病，但不用任何药物治疗。空白对照组既不致病，也不用任何药物。

2.4.4观察每天观察各组鸡只临床症状、鸡只死亡情况并进行详细记录。进行病理剖检。进行实验室病菌确诊验证：进行细菌分离，染色镜检菌体，血清学鉴定。试验结束后，统计治疗结果，分析各组间差异，推荐临床治疗剂量，对“菌毒清”药效进行评价。

3　结果

3.1鸡胚接种出现典型症状鸡胚接种出现绒毛膜变浑浊、变厚及形成痘斑。在鸡肉汤琼脂上生长出圆形、灰白色、半透明、凸起的小菌落。见中插彩版图1、图2。

3.2HPg的ELD50测定结果见表2。

表2　HPg的ELD50测定结果

LgEID50=-1+0.32×（-1）=-1.32 EID50=10-1.32/0.2 mL

该病菌的毒价为EID50=10-1.32/0.2 mL，可以引起鸡胚124 h内半数发生死亡，据此确定该病毒对鸡胚的感染剂量为每只100、10-1、10-2/0.2 mL。剖检鸡胚可见绒毛尿囊膜（CAM）水肿、增厚,有数量不等、大小不一、不透明的灰白色痘斑,胚体表面出血等HPg的特征性病变。

3.3HPg的鸡半数感染量ID50测定结果结果见表3。

表3　各组的潜伏期、发病率、死亡率

距离比值=（80.00%-50%）/（80.00%-26.32%）= 30/53.68=0.56

Lg ID50=-1+0.0.56×（-1）=-1.56 ID50=10-1.56/1.0 mL

该菌株的毒价为ID50=10-1.56/1.0 mL，可以引起鸡半数感染，据此确定HPg对鸡的感染剂量为每只10-1、10-2/1.0 mL。

3.4“菌毒清”治疗试验结果

3.4.1临床症状48 h开始出现症状，鼻孔先流出清液以后转为浆液黏性分泌物，有时打喷嚏，流鼻液，呼吸困难，并有啰音，病鸡摇头，欲将呼吸道内的黏液排出,脸肿胀或显示水肿，结膜发炎，眼睑肿胀。病鸡精神沉郁，食欲及饮水减少，部分鸡拉稀，面部浮肿，缩头，呆立，公鸡肉髯肿大，个别鸡咽喉积有分泌物的凝块，最后常窒息而死。

3.4.2病理剖检主要病变为鼻腔和鼻窦黏膜呈急性卡他性炎，充血、肿胀，表面覆有大量黏液，窦内有渗出物凝块，后成为干酪样坏死物。常见卡他性结膜炎，结膜充血、肿胀。脸部及肉髯皮下水肿。严重时可见气管黏膜炎症，偶有肺炎及气囊炎。

3.4.3实验室病菌确诊验证参照农业部颁布的《鸡传染性鼻炎诊断技术》（NY/T 538-2002）进行确诊验证。

3.4.3.1细菌分离取急性发病鸡、症状明显的鸡，将灭菌的棉拭插入窦腔内部，无菌操作划直线接种在鸡血清鸡肉汤琼脂平板，然后再用葡萄球菌在平板上划横线，37℃，10% CO2培养24 h，观察细菌生长情况。

3.4.3.2染色镜检菌体取分离菌株涂片，革兰染色镜检菌体形态。可见革兰阴性，两极浓染，单个、成对或形成链状排列的小杆菌。

3.4.3.3血清学鉴定用已知的传染性鼻炎抗血清检验分离的被检菌。在载玻片上放1滴抗血清和1滴生理盐水，然后向其中分别加入用被检菌制备的抗原各1滴，充分混合后，转动玻片3～5 min，如果血清滴处出现凝集而生理盐水滴处不凝集，即可判定被检菌为副鸡嗜血杆菌[2]。

3.4.4治疗统计分析结果见表4。

表4　疗效统计分析（治疗期7 d）

从表4可以得出，除G组（健康对照组）外，在290只致病鸡中，发病262只，副鸡嗜血杆菌人工感染后发病率为86.67%～95.00%，平均90.34%（262/290）。经1个疗程的治疗，4个“菌毒清”组的治愈率为62.96%～81.48%，瘟毒清组的治愈率为78.57%；4个“菌毒清”组的有效率为81.48%～94.81%，瘟毒清组的有效率为89.29%。其中以“菌毒清”3组（1.0%菌毒清）的有效率和治愈率最高，比瘟毒清组高5.52个百分点，效果显著。经统计分析，“菌毒清”4个试验组和“瘟毒清”组与阳性对照组差异显著（P<0.05）；“菌毒清”4个试验组和“瘟毒清”组相互之间差异不显著。

4　结论

试验结果表明，“菌毒清”口服液治疗效果“瘟毒清”治疗效果稍好。“菌毒清”口服液按照1.0%比例饮水给药，效率高，治疗费用低，推荐“菌毒清”口服液用量按照1.0%浓度饮水给药。

参考文献：

[1]朱士盛，王新.鸡传染性鼻炎实验室诊断技术[J].中国动物检疫，1995，12（4）：12-14.

[2]赵金红，杜春梅，孙丽波，等.鸡传染性鼻炎的诊断与防治[J].吉林农业大学学报，2010，32（S）：43-44.

Effects of Junduqingoral liquid for artificial avian infectious coryza

NIU Jian-rong，ZHANG Ji-yu，ZHOU Xu-zheng，LI Jian-yong，
LI Bing，WEI Xiao-juan，YANG Ya-jun，LIU Xi-wang （Key Lab of New Animal Drug Project，Gansu Province，Key Lab of Veterinary Drug Development，
Ministry of Agriculture，Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciencesof CAAS，Lanzhou 730050，China）

Abstract：To estimate the efficacy of traditional Chinese medicine preparation Junduqing oral liquid for chicken respiratory disease，the chickens were artificially infected by Haemophilusgallinarum . In our study traditional Chinese medicine Wenduqing was set as the control drug.The chickens were randomly divided into 7 groups，which contained four therapeutical groups of 2.0%，1.5%，1.0% and 0.5% Junduqing in water，and three control groups of 1.0%Wenduqing in water，positive control group and nega⁃tive control group.The water with drug was drunk freely in every group for seven days as a course of treatment.The results showed that the cure rates of the four therapeutical groups were 69.23%，77.78%，81.48% and 62.96% respectively，and Wenduqing con⁃trol group was 78.57%.The effective rates of these 4 groups with Junduqing were 88.46%，88.80%，94.81% and 81.48% respective⁃ly, andWenduqing was 89.29%.There was no significant differences in cure rate and effective rate between 4 Junduqing therapeuti⁃cal groups and Wenduqing control group.However，there had significant differences between these five groups and the positive con⁃trol group（P<0.05）.The experiment demonstrated that Junduqing was an effective traditional Chinese medicine preparation for avi⁃an infectious coryza and was better than Wenduqing in same dosage.

Key words：Junduqing oral liquid preparation；avian infectious coryza；efficacy

作者简介：牛建荣（1968-），男，副研究员，硕士，从事兽医临床和新兽药开发研究，E-mail：lznjr1968@126.com

基金项目：农业部公益性行业专项：防治畜禽卫气分证中兽药生产关键技术研究与应用（201303040-09）

收稿日期：2014-4-24

中图分类号：S858.31

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2015）10- 0087- 03