樱桃谷北京鸭短喙和侏儒综合征的初步研究

宁　康，王　丹，王府民，刘　宁，张　冰，张大丙（中国农业大学动物医学院农业部动物流行病学与人畜共患病重点实验室，北京海淀100193）

樱桃谷北京鸭短喙和侏儒综合征的初步研究

宁康，王丹，王府民，刘宁，张冰，张大丙
（中国农业大学动物医学院农业部动物流行病学与人畜共患病重点实验室，北京海淀100193）

摘要：2014年1月至今，我国部分地区所饲养的樱桃谷北京鸭商品肉鸭发生了一种疾病。为诊断该病，从1个38日龄感染鸭群选典型病例和外观正常者各9只，对其体重、喙和舌头进行了测量和分析，随后进行了分子检测和人工感染试验。结果显示，典型病例的体重（1.40±0.51 kg）和喙长（4.00±0.26 cm）与外观正常者（2.87±0.51 kg和5.74±0.58 cm）存在显著差异，提示该病具有半番鸭短喙和侏儒综合征（Short beak and dwarfism syndrome，SBDS）的特征，即喙短、舌头伸出、生长发育严重受阻。用水禽细小病毒的PCR进行检测的结果显示，从37日龄病例采集的36份组织样品均为小鹅瘟病毒（Goose parvovirus，GPV）阳性。用VP1和VP3序列进行进化分析的结果均显示，樱桃谷北京鸭源毒株与导致半番鸭SBDS的毒株聚为一个分支，二者属GPV的同一类变异株。用GPV阳性样品感染2日龄北京鸭，可复制出与自然病例相似的短喙症状。结果表明，GPV变异株与樱桃谷北京鸭SBDS相关。

关键词：樱桃谷北京鸭；短喙和侏儒综合征；鹅细小病毒

Corresponding authors：ZHANG Da-bing；ZHANG Bing

短喙和侏儒综合征（Short beak and dwarfism syndrome，SBDS）是危害半番鸭的一种病毒性疾病，以喙短、舌头伸出、生长发育严重受阻为特点。在发病群体，约10%～30%的鸭只受影响。该病于1971-1972年在法国首次报道，1997年，在波兰的半番鸭中也发生了该病。2009年，匈牙利研究者Palya等对法国的半番鸭SBDS病例进行了病毒分离和鉴定，确定病原为鹅细小病毒（Goose parvovirus，GPV）的变异株[1]。

1989-1990年间，在我国台湾曾发生过一种发病率和死亡率均很高（86%～100%）的急性传染病。据报道，番鸭、北京鸭、半番鸭、台湾菜鸭（Tsaiya duck）以及白改鸭（Kaiya ducks）等不同品种的鸭均可发病，感染后的存活鸭表现出与半番鸭SBDS类似的症状。研究者认为，该病是由鸭肝炎病毒和番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus，MDPV）混合感染所致，但用SPF鸭进行实验感染试验，只有1株MDPV（902193株）可复制出SBDS的症状[2]。

2014年1月以来，我国部分地区所饲养的樱桃谷北京鸭商品肉鸭发生了一种疾病，从临床症状看，该病与半番鸭SBDS极为相似。在感染群体，10%～60%的鸭子受到影响，因此，该病的发生和流行对我国肉鸭养殖业造成了巨大的经济损失。针对这一现状，笔者开展了研究工作，初步研究结果报告如下。

1　材料与方法

1.1流行病学和临床特征调查2015年，某公司送检6只37日龄樱桃谷北京鸭商品肉鸭病例。笔者对其外观进行了检查，并经剖检观察了内脏组织的大体病变。为了解疾病对鸭只体重、喙和舌头的影响程度，从发病群体选典型病例（短喙、舌头伸出）和外观较为正常的鸭（短喙不明显、舌头未伸出）各9只，测量其体重、喙长、喙宽、舌长和舌宽。测量时，鸭只日龄为38日龄。获得数据后，计算平均值和标准差，用Prism 6.01软件进行统计分析。随后，采用现场调研以及与不同地区养鸭企业进行沟通等方式，对疾病发生和流行的范围、发病率、死亡率以及临床特征进行了调查。

1.2样品采集与处理剖检时，取组织样品，用于PCR检测。从6只鸭子采集组织样品36份，包括心脏、肝脏、脾脏、肾脏、腔上囊和胸腺各6份，按1∶5的比例加入0.9%生理盐水（含1%双抗）磨成匀浆，用12 000 r/min离心10 min，取上清液，用0.22 μm滤器过滤，收获滤液，置-80℃保存。

1.3细菌分离无菌蘸取肝组织，分别接种于胰蛋白胨大豆琼脂（Tryptic soy agar，TSA）和麦康凯琼脂培养基，置37℃培养24 h，观察细菌生长情况。

1.4 PCR检测取200 μL滤液，用组织细胞基因组DNA快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）提取DNA，用Chang等（2000）报道的水禽细小病毒引物和条件[3]进行扩增，预期扩增539 bp 的VP3基因。此外，设计引物对F2512（5′-GAGCCCCTCAGCCAAAA CCAAACC- 3′）和R3156（5′-TGGTCTTTGTGATGACTGTGTTTC- 3′），以扩增VP1基因，预期扩增长度为645 bp，反应条件按Chang等（2000）的报道[3]。

建立25 μL反应体系，包括DNA 5 μL、2×Taq PCR Master Mix（南京诺维赞生物科技有限公司）12.5 μL、上游引物和下游引物各2 μL、ddH2O 3.5 μL。用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检查。

1.5测序和序列分析用EasyPure®Quick Gel Extraction Kit（北京全式金生物技术有限公司）纯化回收PCR产物，连接于pGEM®-T Easy Vector（美国Promega公司），转化大肠杆菌DH5α，取菌液进行鉴定后，选阳性克隆测序。

从645 bp VP1序列中截取443 bp序列，去掉539 bp VP3序列中的引物序列、截取495 bp序列。用BLASTx在GenBank中进行序列相似性检索。从GenBank下载部分GPV分离株的对应VP1 和VP3序列作为参考序列，用CLUSTALW（http:// www.genome.jp/tools/clustalw/）进行在线比对，以获得所测序列之间及其与参考序列的同源性，用MEGA 5.0软件[4]进行进化分析，构建进化树时，用MDRV FM株作为参照。各参考毒株的序列登录号见进化树。

1.6病毒分离取PCR阳性肝脏、脾脏和肾脏样品各1份，作为接种材料，各用5枚12日龄鹅胚、经尿囊腔途径接种进行病毒分离，每枚胚接种0.2 mL滤液，接种后，将鹅胚置38℃培养，观察14 d。在接种后120～140 h收获尿囊液、绒毛尿囊膜和内脏，制成匀浆，按1.2方式进行处理，取滤液进行传代，共传3代，以VP3为靶基因，按1.4方式对各代次培养物进行PCR检测。

1.7动物感染试验因病毒分离效果不理想，故选取PCR阳性样品进行感染试验。预先按文献[5]思路对其他常见水禽病原进行排除，包括禽流感病毒、新城疫病毒、鸭瘟病毒、坦布苏病毒、鸭甲肝病毒、鸭星状病毒、鸭呼肠孤病毒、鸭圆环病毒和产蛋下降综合征病毒。

选2日龄北京鸭40只，随机分为两组，每组20只，一组为接种组，经口服途径接种0.5 mL滤液，一组为对照组，接种等体积生理盐水，置于隔离器中隔离饲养，每日观察，观察2周，分别于接种后6 d和12 d测量两组鸭的体重和喙长。

2　结果

2.1流行病学和临床特征2014年年初，该病在江苏出现，随后以较慢的速度向邻近地区扩散，迄今为止，该病先后在安徽、山东以及河北等地发生和流行。在发生过疾病的鸭场，再次引进雏鸭时，会再次发病。用抗菌药物治疗无效，疾病发生与否与雏鸭来源和所用饲料无相关性。

该病主要发生于樱桃谷北京鸭商品肉鸭，病鸭主要表现为喙短、舌头伸出、发育严重受阻（见中插彩版图1），在感染鸭群，典型病例的比例多为10%～30%，严重者亦可达50%～60%，死亡率很低，或可忽略不计。据农户介绍，在雏鸭5～6日龄时，即可见部分鸭子不愿行走，至9～10日龄时，可观察到部分鸭只生长迟缓，随后便可观察到短喙病例，在3周龄后，鸭群中短喙和生长不良症状更加明显。常见部分鸭只腿骨断裂、不能行走。至40日龄左右出栏时，体重轻者只有1 kg左右，屠宰时可见腿骨和翅膀易折断，比例可达30%～40%。

剖检病鸭，未见内脏器官有特征性病理变化，个别病鸭有心包积液、腿肌和胸肌出血、胸腺肿大并伴有出血点等病变。

如表1和表2所示，在外观正常组中，6只鸭的体重位于正常水平（3.1～3.3 kg），仅3只鸭的体重（2～2.6 kg）比正常水平略低，而典型病例的体重均低于正常水平，其中8只鸭的体重仅为0.8～1.7 kg，两组体重平均值分别为1.40±0.51 kg 和2.87±0.51 kg，差异极显著（P<0.01）。典型病例的喙长4.00±0.26 cm明显短于外观正常组5.74± 0.58 cm，差异极显著（P<0.01）。就舌头宽度而言，典型病例组1.88±0.21 cm与外观正常组2.14± 0.21 cm亦存在显著差异（P<0.05）。两组间喙宽和舌长差异不显著（P>0.05）。

2.2细菌分离培养24 h后，在TSA和麦康凯平板上均未见细菌生长。

2.3PCR检测针对水禽细小病毒的VP1和VP3进行PCR检测，从36份（100%）样品中均扩增出预期长度的条带，图2表示从1只37日龄病例不同组织样品（心脏、肝脏、脾脏、肾脏、腔上囊和胸腺）检出VP3基因的结果。

表1　38日龄外观正常鸭体重、喙和舌头的测量

表2　38日龄典型病例体重、喙和舌头的测量

图2　1只37日龄病例不同组织样品中GPV VP3基因的扩增

2.4序列同源性分析和进化分析测定了11份阳性样品的645 bp和539 bp扩增产物序列，BLASTx结果显示，扩增产物分别为GPV的VP1和VP3基因。Clusat W结果显示，在443 bp VP1和495 bp VP3区，所测毒株之间的核苷酸序列同源性均为100%，与GPV参考毒株对应序列的核苷酸同源性分别为95%～99%和96%～99%，与导致半番鸭SBDS的毒株的同源性均为99%。进化分析结果显示，在443 bp VP1（图3A）和495 bp VP3（图3B）区，所测毒株均与导致半番鸭SBDS的毒株聚类，形成一个小分支。

2.5病毒分离用3份PCR阳性样品接种鹅胚后，仅在接种脾脏样品后96～144 h致死2枚鹅胚，用GPV VP3特异性PCR进行检测，3份样品的3个代次培养物均为弱阳性。

图3　小鹅瘟病毒的进化分析

2.6动物感染试验接种GPV阳性样品后5 d，可观察到临床症状，病鸭主要表现出站立不稳、喜卧、腿瘸等症状，先后有6只鸭（30%）表现出明显的症状。在接种后5～11 d，共死亡3只（15%），病鸭和死亡鸭体型明显小于对照组或同群未表现症状者。在观察期，未见对照组表现出临床症状。

在接种后6 d和12 d，接种组中分别有9只和7只鸭表现出较明显的短喙和生长不良症状，与同组中外观正常者以及对照组相比，体重和喙长差异均极显著（P<0.01），但接种组中外观正常者与对照组之间体重和喙长的差异均不显著（P> 0.05）（表3）。

3　讨论

在我国部分地区所发生的樱桃谷北京鸭疾病具有半番鸭SBDS的特征临床表现，可将该病称为樱桃谷北京鸭短喙和侏儒综合征。测量结果显示，病毒感染对喙的影响极大，但对舌头尺寸的影响较小。即感染发生后，舌头并未变大，而是双喙长度显著短于正常水平，使得舌头露于喙外。事实上，舌头尺寸不仅未变大，反而因长期露于喙外，导致舌尖下垂，舌头还略有萎缩。因此，养殖户所称的“大舌头病”或“长舌头病”并不准确。结合调研结果和文献报道[1]，可见病毒感染多发生于1周龄内，因此，病毒感染可能影响了鸭喙的发育。在自然病例中，常见部分腿瘸的病例，在实验感染试验中，亦复制出腿瘸的症状，这一结果提示，病毒感染可能对鸭的骨骼发育亦产生了影响。

表3　实验感染鸭只与对照组的体重、喙的比较

对于典型病例而言，其体重亦受到极大的影响。因鸭只生长发育受阻，可造成1.1～1.5元/只的直接经济损失。此外，在屠宰时，鸭腿骨和翅膀易折断，鸭头、鸭舌等副产品的质量亦受到影响，还可造成0.3～0.5元/只左右的直接经济损失。由此可见，该病的发生和流行对我国部分地区樱桃谷北京鸭商品肉鸭养殖场所造成的经济损失不可小视。

根据细菌分离结果，可以排除细菌病的可能。所采集的组织样品均呈GPV核酸阳性，提示疾病与GPV感染之间的相关性。序列同源性分析和进化分析结果证实，从樱桃谷北京鸭病例中所检出的GPV与导致半番鸭SBDS的GPV毒株具有相近的遗传演化关系，在进化树中位于同一个小分支，属于GPV的同一类变异株。

据文献[6]报道，经尿囊腔接种10～15日龄鹅胚是分离GPV的适宜途径，但目前种鹅普遍接种GPV弱毒疫苗，鹅胚中必然含有母源抗体，因此，本试验在3个代次鹅胚培养物均只检出弱阳性结果，可能与母源抗体的影响有关。鉴于此，笔者改用GPV阳性样品进行了动物实验，在排除其他

常见水禽病原后，接种GPV阳性样品可复制出与自然病例相似的症状，据此可认为，樱桃谷北京鸭发生SBDS与GPV变异株有关。病毒分离工作仍在进行中，用较高滴度的GPV分离株进行感染试验，将有助于得出更确实的结论。

参考文献：

[1] Palya V，Zolnai A，Benyeda Z，et al . Short beak and dwarfism syndrome of mule duck is caused by a distinct lineage of goose parvovirus [J].Avian Pathology，2009，38（2）：175-180.

[2] Lu Y S，Lin D F，Lee Y L，et al.Infectious bill atrophy syndrome caused by parvovirus in a co-outbreak with duck viral hepatitis in ducklings in Taiwan [J].Avian Diseases，1993，37：591-596.

[3] Chang P C，Shien J H，Wang M S，et al.Phylogenetic analysis of parvoviruses isolated in Taiwan from ducks and geese [J] . Avian Pathology，2000，29（1）：45-49.

[4] Tamura K，Peterson D，Peterson N，et al.MEGA5：molecular evo⁃lutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolution⁃ary distance，and maximum parsimony methods [J].Molecular Bi⁃ology and Evolution，2011，28（10）：2731-2739.

[5]曹贞贞，张存，黄瑜，等.鸭出血性卵巢炎的初步研究[J].中国兽医杂志，2010，46（12）：3-6.

[6] Gough R E .Goose parvovirus infection，In：Calnek B W，Barnes H J，Beard C W，et al.Diseases of Poultry，9th ed [M].Iowa State Press Ames IA，2003：684-690.

Preliminary studies on short beak and dwarfism syndromeof Cherry Valley Pekin duck

NING Kang，WANG Dan，WANG Fu-min，LIU Ning，ZHANG Bing，ZHANG Da-bing
（Key Laboratory of Animal Epidemiology and Zoonosis，Ministry of Agriculture，College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China）

Abstract：From January 2014 to the present，a disease occurred in commercial Cherry Valley Pekin ducks in some regions of China.For the purpose of diagnosis，the body weight and beak size were measured and analyzed for 9 typical cases and 9 apparent⁃ly healthy ducks collected from a 38-day-old diseased population.Subsequently，molecular detection and experimental infections were performed.The body weight（1.40±0.51 kg）and mean length of beaks（4.00±0.26 cm）of the typical cases significantly differ⁃ent from those（2.87±0.51 kg and 5.74±0.58 cm）of the apparently healthy ducks，suggesting that the disease had characteristics of short beak and dwarfism syndrome（SBDS）of mule duck，which is characterized by strong growth retardation with smaller beak and protruding tongue.Using a pan-waterfowl parvovirus PCR assay，thirty-six samples were collected from 37-day-old diseased ducks were tested positive for goose parvovirus（GPV）.Phylogenetic analyses of partial VP1 and VP3 sequences revealed that the GPV strains in this study were grouped together with previously known GPVs from SBDS of mule duck and belonged to a distinct clade of GPV-related group . The signs of SBDS could be reproduced by inoculation of a GPV-positive sample in two-day-old Pekin ducklings.These investigations demonstrated that the disease was associated with the GPV variant.

Key words：Cherry Valley Pekin duck；Short beak and dwarfism syndrome；Goose parovirus

通讯作者：张大丙，E-mail：zdb@cau.edu.cn；张冰，E-mail：zhangdb@cau.edu.cn

作者简介：宁康（1989-），男，博士生，研究方向为动物分子病毒学，E-mail：ningkang@cau.edu.cn

基金项目：现代农业产业技术体系专项资金（CARS-43）

收稿日期：2015-05-01

中图分类号：S852.65+9.2

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2015）10- 0007- 04