YFP- H148Q/I152L在FRT细胞中的表达及其对碘离子敏感特性的研究

郑　锴，朱杭飞，王长文，郭素红，李正祎，藏雨轩，张雲乔，郑　岩，方　芳，郝　峰（.吉林医药学院检验学院，吉林吉林303；.吉林医药学院公共卫生学院，吉林吉林303）

YFP- H148Q/I152L在FRT细胞中的表达及其对碘离子敏感特性的研究

郑锴1，朱杭飞1，王长文2，郭素红1，李正祎1，藏雨轩1，张雲乔1，郑岩1，方芳1，郝峰1
（1.吉林医药学院检验学院，吉林吉林132013；2.吉林医药学院公共卫生学院，吉林吉林132013）

摘要：为探讨YFP-H148Q/I152L在FRT细胞中的表达及其对碘离子的敏感性，应用点突变试剂盒将真核表达载体YFP特异编码序列第148位氨基酸H突变为Q，第152位氨基酸I突变为L，脂质体介导将YFP-H148Q/I152L转染入稳定表达Ano2的FRT细胞中，应用荧光淬灭动力学试验检测YFP-H148Q/I152对其碘离子的敏感性。测序结果证实，成功将YFP突变为YFP-H148Q/I152L，且荧光淬灭动力学试验表明，表达YFP-H148Q/I152L的FRT细胞在加入激活剂和碘离子后，相对荧光强度显著下降。表明成功构建YFP-H148Q/I152L真核表达载体，并证实表达于FRT胞浆中的YFPH148Q/I152L具有对碘离子敏感的特性。

关键词：YFP-H148Q/I152L；FRT细胞；相对荧光强度

Corresponding author：HAO Feng

目前，荧光蛋白具有稳定性好、耐受性强和无毒害等优点[1]，成为在揭示分子或细胞活动规律和本质的一个精确工具[2]。Ano2是表达在细胞膜上的一种钙激活氯离子通道，能转运卤族元素[3]。研究认为Ano2是治疗囊性纤维化、高血压和哮喘等[3-4]疾病的药物靶点。氯离子通道的检测方法有很多，如膜片钳技术和荧光染料等。膜片钳被称为研究氯离子通道的金标准，但它不能高通量筛选和价格十分昂贵等缺点[5]。荧光染料是一种消耗品，易发生荧光漂白等现象[6]。因此，本试验构建YFP-H148Q/I152L真核表达载体，验证其具有对FRT细胞中碘离子敏感的特性，对氯离子通道开放情况与调节剂筛选等研究奠定了重要的基础。

1　材料与方法

1.1材料YFP-pRSETB和pcDNA3.1，由麻彤辉教授馈赠；QuickchangeTM点突变试剂盒，购自Stratagene公司；稳定表达pEGFP-Ano2的FRT细胞，由实验室保存；倒置荧光显微镜，购自Nikon公司；Fluostar多功能酶标仪，购自德国BMG公司。

1.2重组载体YFP-pcDNA3.1的构建和鉴定将YFP-pRSETB和pcDNA3.1载体为模板，PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳试验，分别用Hind III和EcoR V双酶切PCR产物，运用DNA凝胶回收试剂盒进行双酶切后产物回收，Nanodrop 2000分光光度计测定。利用T4连接酶将载体pcDNA3.1和目的基因YFP按1∶3比例4℃作用12 h。将YFP-pcDNA3.1进行转化并提取质粒，DNA琼脂糖凝胶电泳检测正确后，送于上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.3YFP-H148Q/I152L真核表达载体的构建根据GenBank查询YFP的特异编码区序列（GQ22-1700.1），设计引物，将第442-444位的碱基CAC突变为碱基CAG，第454-456位碱基ATC突变为碱基CTG则sense：5′- CTACAACAGCCAGAACGTCTATCTGATGGCCGACAAGCAGAA-3′，antisense：5′- TGTCGGCCATCAGATAGACGTTCTGGCTGTTGTGTTGTACT-3′。以重组载体YFP-pcDNA3.1为模板进行PCR试验以合成YFP-H148Q/I152L。此时所用的DNA聚合酶为具有高保真能力的pfu DNA聚合酶。运用DNA琼脂糖凝胶电泳进行分离检测正确后，取2 μL PCR产物、1 μL DpnI、5 μL 10× Buffer 4 μL和42 μL超纯水，在37℃的恒温水浴锅中酶切4 h。YFP-H148Q/I152的转化、质粒提取和测序步骤与上述大致相同，只是DH5α改为QuickchangeTM点突变试剂盒中E.coli XL1-Blue。

1.4YFP-H148Q/I152L转染入FRT细胞将含0.5 μg YFP-H148Q/I152L的基本培养液与含2.5 μL脂质体Lipofectamine LTX的基本培养液混匀转染入状态良好铺满96孔板的单层FRT细胞中，6 h后弃去基本培养液，加入完全培养液，48 h后在倒置荧光显微镜下观察结果。

1.5荧光淬灭动力学试验将状态均一良好并已表达YFP-H148Q/I152L的FRT细胞，用PBS洗涤3次，最后1次留50 μL PBS于96孔板中，利用Fluostar多功能酶标仪加入200 μmol/L carbachol 和120 μL不同浓度的I-溶液，并检测相对荧光强度。未加carbachol的NaI溶液和加入含Ano2抑制剂NFA（200 μmol/L）的NaI溶液作为对照。

2　结果与分析

2.1YFP-H148Q/I152L酶切结果重组载体YFPH148Q/I152L进行Hind III/EcoR V双酶切，琼脂糖凝胶电泳得到2条清晰的条带，分别为720 bp和5 597 bp左右，则表明成功构建黄色荧光蛋白双突变体YFP-H148Q/I152L（图1）。

图1　YFP- H148Q/I152L酶切结果

2.2YFP-H148Q/I152L blast结果和测序结果

Blast结果显示，YFP的第148位的H变为Q和第152位的I变为L（见中插彩版图2A）。测序结果显示，本试验构建的重组载体YFP-H148Q/I152L第519-521位碱基为CAG，第531-533位碱基为CTG（见中插彩版图2B）。Blast结果和测序结果均表明，将YFP成功突变为YFP-H148Q/I152L。

2.3YFP-H148Q/I152转染入已稳定表达Ano2的FRT细胞前期试验，已将Ano2转染入FRT细胞中，在明视野（见中插彩版图3A）和暗视野下（见中插彩版图3B）观察，结果显示，FRT细胞膜上表达绿色荧光，则证实FRT细胞已稳定表达Ano2。将YFP-pcDNA3.1转染入FRT细胞中，倒置荧光显微镜下观察到FRT胞浆中表达黄色荧光，则证实FRT胞浆中表达黄色荧光蛋白双突变体YFPH148Q/I152（见中插彩版图3C）。

2.4荧光淬灭动力学试验结果加入Carbachol 和NaI溶液，结果表明，FRT细胞中相对荧光强度显著下降（图4A）。未加Carbachol的NaI溶液和加入含Ano2的NFA的NaI溶液，其相对荧光强度不变（图4B）。本试验结果证实，FRT胞浆中的具有对碘离子敏感的特性。

图4　荧光淬灭动力学试验结果

3　讨论

氯离子是细胞外含量最多的阴离子，能够调节氯离子的动态平衡和液体运输等[7]。PCR定点突变技术为目前实验室中改造基因常用手段之一。定点突变技术可应用于改造蛋白的活性和基因治疗等方面[8]。总之，本试验成功构建黄色荧光蛋白双突变体YFP-H148Q/I152L重组载体，并表达于FRT胞浆中，同时证实YFP-H148Q/ I152L在FRT胞浆中表达具有对碘离子敏感的特性，为研究钙激活氯离子通道的开放情况与调节剂的筛选提供一个精确的检测工具，对氯离子通道开放情况与调节剂筛选的研究奠定了重要的基础。

参考文献：

[1] Pan Y，Leifert A，Graf M，et al . High- Sensitivity Real- Time Analysis of Nanoparticle Toxicity in Green Fluorescent Protein-Expressing Zebrafish[J].Small，2013，9（6）：863-869.

[2] Shirmanova M V，Serebrovskaya E O，Lukyanov K A，et al.Photo⁃toxic effects of fluorescent protein KillerRed on tumor cells in mice[J].Journal of biophotonics，2013，6（3）：283-290.

[3] Galindo B E，Vacquier V D . Phylogeny of the TMEM16 protein family：some members are overexpressed in cancer[J] . Int J Mol Med，2005，16（5）：919-924.

[4] Verkman A S，Galietta L J.Chloride channels as drug targets[J]. Nat Rev Drug Discov，2009，8（2）：153-171.

[5] Katz Y，Yizhar O，Staiger J，et al.Optopatcher-An electrode hold⁃er for simultaneous intracellular patch-clamp recording and opti⁃cal manipulation[J] . Journal of neuroscience methods，2013，214 （1）：113-117.

[6] Kornreich B G.Vet Cardiol[J].The patch clamp technique：princi⁃ples and technical considerations，2007 May；9（1）：25-37.

[7] Huang F，Wong X，Jan LY.International Union of Basic and Clin⁃ical Pharmacology[J] . LXXXV：calcium-activated chloride chan⁃nels. Pharmacol Rev，2012 Jan；64（1）：1-15.

[8]王鹏，张熙艳，时建立，等.PCV2 Rep蛋白N-糖基化位点突变及其真核表达载体的构建[J] .中国兽医杂志，2014，50 （1）：24-26.

Expression of YFP- H148Q/I152L in FRT cells and investigation of iodineion sensitivity

ZHENG Kai1，ZHU Hang-fei1，WANG Chang-wen2，GUO Su-hong1，LI Zheng-yi1，ZANG Yu-xuan1，ZHANG Yun-qiao1，ZHENG Yan1，FANG Fang1，HAO Feng1
（1.Department of Medicine Laboratory，Jilin Medical College，Jilin 132013，China；2.Department of Public Health，Jilin Medical College，Jilin 132013，China）

Abstract：To investigate the expression of YFP-H148Q/I152L in FRT cells and its property to iodine ion sensitivity.Methods: The QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit was applied and then the YFP-pcDNA3.1 of the 148th amino acids as H was mu⁃tated into Q and the 152th amino acids as I was mutated into L . The eukaryotic expression vectors of YFP-H148Q/I152L were transfected into FRT cells with expressed Ano2 by liposome.The iodine ion sensitivity of YFP-H148Q/I152L was detected by the test of kinetics of fluorescence quenching .Results：The results of sequencing indicated that YFP was mutated into YFP-H148Q/ I152L.The results of the test of kinetics of fluorescence quenching indicated that in FRT cells added activator and iodine ion，the relative fluorescence intensity of YFP-H148Q/I152L was significantly decreased . Conclusions：The eukaryotic vector of YFPH148Q/I152L was successfully established and it was confirmed that the expressed YFP-H148Q/I152L in FRT cytoplasms was sen⁃sitive to iodine ion.

Key words：YFP-H148Q/I152L；FRT cells；relative fluorescence intensity

通讯作者：郝峰，E-mail：haof863@126.com

作者简介：郑锴（1980-），女，讲师，硕士，研究方向为氯离子通道，E-mail：carane@163.com

基金项目：吉林省教育厅基金资助课题（2013-351）；2014年吉林省大学生创新创业训练计划；2013年吉林省大学生创新创业训练计划；吉林医药学院大学生科研基金资助课题（吉医学科字[2012]第12号）；国家自然科学基金资助项目（81202031）

收稿日期：2014-09-19

中图分类号：Q785.786，Q256

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2015）10- 0011- 03