山东分离株鸡腺胃型传染性支气管炎的病理组织学和电镜观察

王玉东，王永玲，王君玮，王晓燕，高艳艳，王树双，谭金山，牛钟相（.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛660；.中国农业大学国际合作与交流处，北京海淀0008；.青岛大学医学院，山东青岛660；.山东农业大学动物科技学院，山东泰安708）

山东分离株鸡腺胃型传染性支气管炎的病理组织学和电镜观察

王玉东1，王永玲1，王君玮1，王晓燕2，高艳艳1，王树双1，谭金山3，牛钟相4
（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛266032；2.中国农业大学国际合作与交流处，北京海淀100083；3.青岛大学医学院，山东青岛266021；4.山东农业大学动物科技学院，山东泰安271018）

摘要：为探讨鸡腺胃型传染性支气管炎病毒（腺胃型IBV）引起鸡的病理组织变化和病毒超微结构特征，采用常规临床剖检、病理组织学显微观察技术及电子显微镜观察技术，对山东省3株病毒分离株（QX、DY、FC）引起的病理组织学变化和病毒的超微结构进行观察。结果表明，分离毒株可引起明显的腺胃组织炎症，主要表现腺胃黏膜内炎性细胞浸润，腺胃腺体上皮细胞增生，腺腔中有黏液、有多量坏死、脱落、崩解的腺细胞，以及单核细胞浸润，上皮细胞有多量空泡化等特点。在病理组织中观察到了大小为80～120 nm的病毒颗粒；通过鸡胚分离的病毒大小为80～150 nm，该病毒略呈球形或梨形，有囊膜，囊膜表面覆有长12～25 nm的呈典型冠状的突起（团集的病毒则较少有冠状突起），为冠状病毒。该结果为进一步研究和有效防治腺胃型传染性支气管炎提供了科学参考。

关键词：鸡；传染性支气管炎；腺胃型；病毒；病理组织；电镜观察

Corresponding author：NIU Zhong-xiang

近年来，以鸡腺胃肿大、黏膜增厚、溃疡出血、有脓性分泌物、死亡率较高为特征的腺胃型传染性支气管炎的发生呈上升趋势，对养鸡业造成了严重威胁。由Y.M.Saif主编的《禽病学》引用了王玉东关于鸡腺胃型传染性支气管炎（QX IBV）分离株的报道[1]。2001年潘杰彦等[2]报道中国青岛腺胃型传支病毒株（SD/97/02株原称QX IBV株）的S1基因全序列及推导出的氨基酸序列被病毒基因库（Gen⁃Bank）所收录，收录号为AF193423。随后QX样IBV在欧洲、亚洲和非洲等地多有发生，在许多研究中均参照QX IBV基因型。王玉东等[3]通过对山东分离株S基因的克隆和序列分析，表明腺胃型IBV山东分离株QX株和DY株是不同于呼吸型和肾型IBV的嗜腺胃型的IBV变异株，腺胃型QX株和DY株的相似性为95.8%。王玉东等[4-6]认为，本病病原是一种冠状病毒属的嗜腺胃型的传染性支气管炎病毒变异株。王玉东等[7]进行的国内有关分离毒株（QX、BJ、DY）进行未免疫同源动物回归试验取得了成功。王玉东等[8]用腺胃型传染性支气管炎病毒山东分离毒株对SPF鸡致病性试验取得了成功。本研究对山东典型分离株的病理组织学变化和病毒超微结构进行了电镜观察，取得了满意的结果，为进一步研究和防治鸡腺胃型传染性支气管炎提供了科学依据。

1　材料与方法

1.1病鸡或病死鸡25～80日龄病鸡和病死鸡，取自山东省青岛市、东营市和肥城市等地发病的养鸡场。

1.2病毒分离株山东省腺胃型IBV典型分离株青岛株（QX IBV）[6]、东营株（DY IBV）、肥城株（FC IBV），均由中国动物卫生与流行病学中心分离、鉴定和保存。

1.3仪器组织切片机，购自德国莱卡公司；LKB-V型超薄组织切片机，购自瑞典BROMMA公司；光学显微镜，购自日本OLYMPUS公司；JEOL-100cxⅡ型透射电镜，购自日本电子株式会社（JE⁃OL公司）；电子显微镜，购自日本HITACHI公司。

1.4病理组织学标本制备取临床自然发病鸡或回归试验病死鸡中表现明显肿胀的腺胃、肾脏及其他相关病料，切成豆粒状大小用2.5%戊二醛保存。观察时用10%中性福尔马林固定，用组织切片机常规石蜡切片，苏木素－伊红（H.E.）染色，光镜观察。

1.5病毒分离和电镜观察取发病鸡腺胃，研磨器研碎，制成10%生理盐水组织悬液，上清经无菌处理后，接种10日龄SPF鸡胚尿囊腔，0.2 μL/枚，置37℃继续孵育，接种后24 h照蛋，死胚弃掉；孵育至5～6 d，收获鸡胚尿囊液。然后盲传4～5代，致严重的鸡胚侏儒化时取山东分离株QX株、DY株和FC株病毒尿囊液，不离心，用2%磷钨酸负性染色5～10 min后，进行电子显微镜观察。

对分离的尿囊液病毒在4℃下，15 000 r/min分别离心20 min，取上清，36 000 r/min离心3 h，取沉淀，用少量PBS溶解稀释，用2%磷钨酸负性染色5～10 min，进行电子显微镜观察。参照王碧林的方法进行离心[9]。

1.6腺胃组织中病毒观察剖杀病鸡，取腺胃组织，切成1 mm3大小，2.5%戊二醛固定2 h，用0.1 mol/L pH值为7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，用1%锇酸后固定2 h，酒精逐级脱水，无水丙酮替换，Epon812包埋树脂聚合、包埋，LKB-V型超薄切片机切片，捞取呈金－银色切片，醋酸铀－柠檬酸铅双重染色，用JEOL-100cxⅡ型透射电镜观察并照相。参照吴延功等[10]进行超薄切片制作和观察。

2　结果

2.1病理剖检将收集的25～80日龄发病鸡和病死鸡剖检，均发现鸡体极度消瘦，腺胃肿大如球状（见中插彩版图1）。腺胃壁增厚明显，其黏膜有出血和溃疡，乳头平整融合，轮廓不清，可挤出脓性分泌物。有的腺胃肿胀、出血，乳头消失凹陷，形成出血溃疡灶。肌胃角质膜个别有溃疡，胰腺肿大有出血点，盲肠扁桃体肿大出血。十二指肠黏膜有出血，空肠和直肠及泄殖腔黏膜有不同程度的出血。腔上囊正常或略有肿大。有的鸡肾脏肿大，肾脏和输尿管积有白色尿酸盐。

2.2病理组织学将病变腺胃用常规石蜡切片、苏木素－伊红（H.E.）染色、镜检发现，腺胃乳头出口部有多量黏液并混有多量细胞。腺胃黏膜内炎性细胞浸润伴溃疡形成，间质血管扩张、充血、水肿（见中插彩版图2）；腺胃腺体上皮细胞增生，腺腔中有黏液、有多量坏死、脱落、崩解的腺细胞，以及单核细胞浸润，上皮细胞有多量空泡化。管腔中也有脱落的上皮细胞，腺体下平滑肌层被水肿液分隔，固有层水肿，毛细血管充血。腺胃腺体内有多量炎性细胞浸润，增生细胞有淋巴细胞、白细胞和浆细胞等（见中插彩版图3）；腺胃肿大、炎症表现严重的病例，病变可以深入到平滑肌层，导致肌肉实质变性或蜡样坏死。病鸡肾脏组织变化主要为肾小球和小管轻度肿胀，间质出血（见中插彩版图4）。

2.3分离病毒电镜观察不同分离株病毒经电镜观察发现，均有囊膜、多形态、略呈球形或梨形、直径为80～150 nm之间，囊膜表面覆有长12～25nm的冠状突起。在连续冻融后，往往看不到明显的突起，但病毒内结构相同。超速离心处理后，有时观察到大量病毒团集，团集病毒其冠状结构不明显。山东分离株QX、DY、FC株分离病毒的尿囊液中均未发现其他病毒，均为单一的冠状病毒，见图5～6。

图5　QX株病毒的电镜照片，直径约为120～150 nm（×120 K）

图6　QX株团集病毒电镜照片，直径为100～150 nm（×80 K）

2.4腺胃组织病毒电镜观察对QX株腺胃组织进行电镜观察，结果发现，在腺胃组织中有大量直径为80～120 nm的病毒颗粒存在，见箭头所指，见图7。

图7　QX株球形病毒颗粒，直径为80～120 nm（×40 K）

3　讨论

3.1病毒嗜性山东分离的3株腺胃型IBV毒株具有明显的嗜呼吸系统、嗜腺胃及肠道等消化系统的特征。患病鸡主要表现呼吸道症状，消瘦，发育不良，死亡率高。剖检以腺胃肿大如球状，腺胃黏膜有出血和溃疡，腺胃乳头平整融合，轮廓不清，可挤出脓性分泌物，肌胃角质膜个别有溃疡、出血、肠道出血等主要特征。

3.2病理组织学变化主要表现腺胃的炎性变化。腺胃黏膜内炎性细胞浸润，间质血管扩张、充血、水肿，腺胃腺体上皮细胞增生，腺腔中有黏液，有多量坏死、脱落、崩解的腺细胞，以及单核细胞浸润，上皮细胞有多量空泡化等特点。

3.3分离病毒的特征山东分离毒株（QX、DY、FC株）3株病毒液中的分离病毒都呈球形、梨形或多形性，病毒离子大小多在100～120 nm之间,最大为150 nm，最小为80 nm。病毒表面的纤突一般为15～20 nm，当超速离心后，观察到大量的病毒团集（如QX株和DY株），团集病毒一般看不到表面纤突结构。

本研究从山东分离的3株腺胃型IBV病毒分离物中均未发现新城疫病毒（100～500 nm，突起长约8 nm）、网状内皮组织增殖病病毒（100nm,突起长约6 nm）、呼肠孤病毒（75 nm）、细小病毒（20～22 nm）等其他病毒存在。据吴延功研究报道[10]，对病毒分离物进行电镜观察，从青岛分离的SDQD97株病毒和另1株病毒皆为冠状病毒。

王玉东等[8]在进行山东分离株病毒未免疫鸡致病试验时，进行了外源病毒抗体和白血病抗原的检测，均未检测到新城疫病毒、马立克病毒、网状内皮组织增殖病病毒、呼肠孤病毒、传染性囊病病毒、传染性贫血病毒等其他外源病毒的抗体，也未检测到白血病病毒抗原。

3.4腺胃组织中的病毒特征从QX株病毒感染的腺胃组织中观察到大小约80～120 nm、呈球形病毒颗粒，经鉴定为传染性支气管炎病毒（IBV）。未发现网状内皮组织增殖病病毒（REV）和新城疫病毒（NDV）等其他病毒。经对QX株腺胃组织进行电镜观察，未发现吴延功等[10]提及的新城疫病毒、网状内皮组织增殖病病毒及另一种大小为60～80 nm的病毒（分布于细胞间隙中）。也未发现呼肠孤病毒，与沈美艳[11]的研究不同。

3.53株山东分离株病毒皆为腺胃型IBV，10多年来，使用腺胃型传染性支管炎QX株病毒生产的油乳剂灭活疫苗已经被广泛使用。疫苗免疫保护率在95%以上，疫苗安全性为100%[5，12]。本研究通过对山东分离株（QX、DY、FC）病毒引起鸡的临床症状、病理变化、病毒组织学特征、分离病毒电镜观察，病理组织中病毒的电镜观察等研究，表明引起腺胃肿大、黏膜溃疡出血为特征腺胃型的病原为冠状病毒属的传染性支气管炎变异株。

腺胃型IBV是不同于呼吸型、肾型、生殖型传染性支气管炎病毒（IBV）的变异株，但与肾型IBV毒株有高度的同源性[3，5-6]。国际上当前普遍认为QX样IBV为一种肾型传支株，2008年意大利Ca⁃logero Terregino等[13]报道，意大利分离株IBV-QX株对SPF鸡和商品肉鸡的致病性及基于IB Ma5和4/91变异株疫苗免疫诱导保护反应的评价论文中提到，在蛋鸡和肉鸡场在1日龄和14日龄时免疫Ma5和4/91变异株疫苗，对降低发生QX IBV感染时的经济损失具有帮助作用。

2004年1月荷兰Geerligs H J等[14]分离到1株IBV变异株,通过基因库搜索，该病毒株与中国青岛分离株QX IBV毒株具有98.1%的S基因相似度，并将其命名为IB-QX病毒。

3.6腺胃型IBV研究动态近年来该病呈世界性流行，其研究也有较大的发展。2005年Beato M S等[15]报道了IBV-QX株在意大利传播流行的证据。2011年泰国Tawatchai Pohuang等[16]分离的IBV病毒进行S1基因的序列分析，引用了QX IBV的报道；2012年瑞典Abro S H等[17]报道，IBV-QX病毒血清型按全长基因序列分型，除了中国QX血清型外，现分离到许多欧洲QX血清型，包括比利时、丹麦、法国、德国、匈牙利、意大利、荷兰、波兰、俄罗斯、斯罗文尼亚、西班牙、瑞典和英国等都有相关报道，其分离毒株的基因序列都与QX IBV接近。2012年伊拉克Amin O G M等[18]报道了QX样IBV毒株在中东的传播，并对许多国家的病毒分离株进行了基因进化分析。2012年张小荣等[19]分离的两株河北分离IBV株属于QX IBV基因型。2014年德国Mork A K等[20]报道了冠状病毒IBV-QX株和B1648病毒纤突蛋白特性的比较。近来来，QX样IBV感染病例呈现世界范围蔓延的趋势。

建议继续开展本病的病原学研究，确定该病病原，建立防制机制，完善我国禽病学IBV相关内容，与国际禽病学接轨。

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Histopathology and Electron Microscopy Observation of Shandong Isolates of Glandular Stomach Type Avian Infectious Bronchitis Virus

WANG Yu-dong1，WANG Yong-ling1，WANG Jun-wei1，WANG Xiao-yan2，GAO Yan-yan1，WANG Shu-shuang1，TAN Jin-shan3，NIU Zhong-xiang4
（1.China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao 266032，China；2.Office of International Relations，China Agricultural University，Beijing 100083，China；3.College of Medicine，Qingdao University，Qingdao 266021，China；4.College of Animal Science and Technology，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018，China）

Abstract：In order to investigate histo-pathological changes of chickens induced by glandular stomach（GS）type avian infec⁃tious bronchitis virus and the ultra-structure of the virus，clinical dissection，histo-pathology and electron microscopic examination were conducted over the 3 Shandong isolates（QX，DY and FC）of stomach type avian infectious bronchitis virus and the ultrastructure of the virus . The results showed that the isolates induced significant glandular stomach tissue inflammation manifested mainly in inflammatory cell infiltration in proventriculus mucosa，glandular epithelial hyperplasia，mucus and abundant necrotic，exfoliated and disintegrated glandular cells in gland lumen，monocyte infiltration and abundant vacuolation in epithelial cells.Viral particles with 80～120 nm were observed in the pathological tissues .Virus isolated via chicken embryo was too 80～150 nm in size with spherical or pear-shaped form.The virus was enveloped with 12～25 typical coronoid projections（the clustered virus has few coronoid projections），thus named as coronavirus.The study provided scientific reference for further studies and effective pre⁃vention and control of glandular stomach type avian infectious bronchitis.

Key words：Chicken；Avian infectious bronchitis；Glandular stomach type；Virus；Histopathology；Electron Microsco⁃py Observation

通讯作者：牛钟相，E-mail：zxniu@sdau.edu.cn

作者简介：王玉东（1964-），男，副研究员，本科，主要从事动物疫病防制、生物制品研究及动物产品安全检测评估工作，E-mail：andy56789@139.com

收稿日期：2014-11-21

中图分类号：S852.65+9.6

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2015）10- 0024- 04