车前草多糖对雏鸡新城疫疫苗免疫效果的影响

陈家磊，刘师旗，冯　君，郑业龙，聂　奎（西南大学动物科技学院，重庆北碚400715）

车前草多糖对雏鸡新城疫疫苗免疫效果的影响

陈家磊，刘师旗，冯君，郑业龙，聂奎
（西南大学动物科技学院，重庆北碚400715）

摘要：为研究车前草多糖对雏鸡新城疫疫苗免疫效果的影响，将350只雏鸡随机分为7组，于8日龄、22日龄进行新城疫疫苗首免和二免，同时给予车前草多糖，并以黄芪多糖和铝胶盐佐剂作为对照，分别在首免后第7、14天，二免后第7、14、21天进行血清抗体效价和淋巴细胞增殖率的测定，于二免后第21天用新城疫病毒进行攻毒，连续观察10d内鸡的发病及死亡情况。结果显示，车前草多糖能显著提高雏鸡新城疫疫苗的免疫抗体效价、增强雏鸡的淋巴细胞增值率，与黄芪多糖的作用无显著性差异（P>0.05），但车前草多糖提高抗体效价作用较黄芪多糖、铝胶盐佐剂的维持时间长；在新城疫病毒攻毒后10 d，未免疫组雏鸡全部死亡，车前草多糖高、中剂量组的攻毒保护率为100%，车前草多糖低剂量和黄芪多糖的保护率为90%，而铝胶佐剂和ND疫苗免疫组的保护率仅为70%。试验结果表明，车前草多糖能提高新城疫疫苗的抗体效价水平和增强T淋巴细胞的增殖率。

关键词：车前草多糖；新城疫疫苗；T淋巴细胞；抗体；雏鸡

Corresponding author：NIE Kui

研究显示，许多植物多糖具有生物活性，包括免疫调节、抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂等作用，尤其是植物多糖具有活化巨噬细胞、增强NK细胞与LAK细胞活性、增强TD细胞功能、诱生细胞因子、调节神经内分泌免疫网络等作用，显著地提高机体细胞免疫和体液免疫的能力[1-4]。

车前草是我国传统药材之一，现代中药药理学研究表明，车前草多糖（Plantain polysaccharide）与黄芪多糖具有L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、葡萄糖醛酸等相同的多糖成分[5-6]。目前，有关车前草的研究主要集中在化合物的提取及其含量测定、化学成分与药理研究等研究方面[7]，对于车前草多糖对动物机体的免疫功能影响方面的研究尚未见报道，本试验通过观察车前草多糖对雏鸡免疫新城疫疫苗后血清抗体效价和T淋巴细胞增值率的变化情况，研究车前草多糖对动物的免疫效果，试验报告于下。

1　材料与方法

1.1试验动物1日龄罗曼蛋公鸡，购自重庆市大足某鸡场。

1.2试验药物车前草（Plantago asiatica L）干燥全草，购自重庆市中药市场，经鉴定合格备用。车前草多糖由本实验室用水浴醇沉法制备，按硫酸-苯酚法测得车前草多糖纯度为75.88 mg/g；黄芪多糖纯原粉，纯度50%（四川省什邡市华康药物原料厂，批号010125231）；20%氢氧化铝胶生理盐水（中牧实业股份有限公司江西生物药厂，批号1210015）；鸡新城疫（ND）活疫苗（LaSota株）（浙江诺倍威生物技术有限公司，批号11057200-7），新城疫病毒（重庆株）由本校荣昌校区动物医学系胡世君副教授赠送，经接种鸡胚后分离病毒，测得病毒的LD50=101.3，1 mL。

1.3主要试剂刀豆蛋白（BIOSHARP公司，批号C-2010）；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）（Amresco公司，批号298-93-1）；鸡外周血淋巴细胞分离液（天津市瀬洋生物制品科技有限责任公司，批号LTS1090C）；改良型RPMI1640培养基（赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司，批号NXE0635）。

1.4主要仪器680 BIO-RAD酶标仪（美国BIO-RAD公司），Thermo Forma 3111 CO2细胞培养箱等。

1.5试验动物分组及处理雏鸡至8日龄随机分为7组，每组50只，将新城疫弱毒苗（0.05 mL）分别与车前草多糖的高剂量（50 mg/mL）、中剂量（25 mg/mL）、低剂量（12.5 mg/mL）、黄芪多糖（0.5 mL）、铝胶盐（0.05 mL）、生理盐水（0.5 mL）混匀后，分别给各组雏鸡点眼滴鼻进行接种免疫，至22日龄，肌肉注射进行第二次免疫。

1.6鸡新城疫血凝抑制抗体效价的测定于雏鸡首免后第7（D7）天、第14（D14）天，二免后第7 （D21）天、第14（D28）天、第21（D35）天，每组分别随机抽取3只雏鸡，翼下静脉采血，5 mL/只，血清析出后1 000 r/min离心5 min分离血清，用微量血凝抑制试验（HI）测定鸡新城疫血清抗体滴度[8]，结果以log2表示。

1.7淋巴细胞增殖率的测定分别于首免后第7 （D7）天、第14（D14）天，二免后第7（D21）天、第14 （D28）、第21（D35）天，每组随机抽取3只鸡无菌心脏采血（EDTA抗凝），5 mL/只，用MTT法测定淋巴细胞增殖率动态变化[8]。

1.8各组雏鸡的攻毒保护试验在首免后第35天各组随机选10只雏鸡颈部皮下注射新城疫强毒，各组鸡攻毒后分别饲养通风的隔离器中，观察并记录鸡采食、精神、发病及死亡情况，连续观察10 d。死亡鸡剖检，观察病理变化。

1.9数据处理数据均用Microsoft Excel 2003软件分析以平均值±标准偏（mean±SD）差表示，以P<0.05表示差异显著。

2　结果

2.1车前草多糖对鸡新城疫血凝抑制抗体效价的影响从首免后第7天到二免后第21天，经ND疫苗免疫的各组雏鸡的ND抗体效价水平呈逐步上升，且显著高于不免疫组雏鸡（P<0.05）。首免后第7天，经ND疫苗免疫的各组雏鸡的抗体效价差异不显著（P>0.05），但在首免后第14天，ND疫苗+车前草多糖中剂量组雏鸡的抗体效价显著高于ND疫苗免疫组雏鸡的抗体效价（P<0.05），且车前草多糖中剂量组和黄芪多糖组雏鸡的抗体效价显著高于铝胶佐剂组（P<0.05）。在ND疫苗二免后第7天，ND疫苗免疫+车前草多糖、黄芪多糖及铝胶佐剂组的雏鸡的抗体水平显著高于空白对照组，但各组间雏鸡的差异不显著（P>0.05）；二免后第14天时，车前草多糖中剂量组雏鸡的抗体水平显著高于车前草多糖高剂量组和铝胶佐剂组（P<0.05）；到二免后第21天，车前草多糖中、低剂量组雏鸡的抗体效价均显著高于黄芪多糖组、铝胶佐剂组和ND疫苗组（P<0.05），且车前草多糖中、低剂量组雏鸡的抗体效价均显著高于车前草多糖高剂量组（P<0.05），见表1。

表1　车前草多糖对鸡新城疫HI抗体滴度的测定结果　（Log2；±SD，n=3）

2.2车前草多糖对T淋巴细胞增殖的影响首免后7～14 d，经ND疫苗免疫的车前草多糖、黄芪多糖和铝胶佐剂组雏鸡的淋巴细胞增殖率差异不显著（P>0.05），但都明显高于ND疫苗免疫组雏鸡的淋巴细胞增殖率。二免后7～14 d，ND疫苗+车前草多糖高剂量组、ND疫苗+车前草多糖中剂量组、ND疫苗+车前草多糖低剂量组和ND疫苗+黄芪多糖组雏鸡的淋巴细胞增值率均显著高于ND疫苗+铝胶佐剂组和ND疫苗组（P<0.05），而ND疫苗+铝胶佐剂组雏鸡的淋巴细胞增值率与ND疫苗组的差异不显著（P>0.05）。同时，在二免后第7天，ND疫苗免疫+车前草多糖和黄芪多糖组雏鸡的促淋巴细胞增值率分别为30.0%、24.3%、26.0%和23.3%，达到最高值，之后出现下降，见表2。

表2　车前草多糖对新城疫疫苗免疫鸡T淋巴细胞增殖的影响　（±SD，n=3）

2.3各组鸡的攻毒保护试验结果攻毒后第4天，未用疫苗免疫的空白组雏鸡全部出现精神沉郁，食欲下降等临床症状。攻毒后第5天未进行免疫的空白组雏鸡出现眼角膜有黏液、神经症状并死亡3只，至第7天全部死亡。车前草低剂量组和黄芪多糖组各有1只鸡出现精神不振、腹泻、食欲减退等症状；铝胶佐剂组和ND疫苗组各有1只死亡。第6天，空白组雏鸡死亡5只，铝价佐剂组2只出现腹泻症状，ND疫苗免疫组雏鸡死亡1只。攻毒10 d后，车前草多糖高、中剂量组的攻毒保护率为100%，车前草多糖低剂量和黄芪多糖的保护率为90%，而铝胶佐剂和ND疫苗免疫组的保护率仅为70%。对所有存活鸡剖杀观察组织变化，车前草多糖组和黄芪多糖组均无肉眼可见病变，铝胶组和ND疫苗组各有1只腺胃乳头充血。各组鸡攻毒后的病变、死亡情况见表3。

表3　车前草多糖对新城疫疫苗免疫鸡的攻毒保护试验

3　讨论

《神农本草经》将车前草（Plantago asiatica L.）列为上品药材，《中国药典》载入药的是车钱（Plantago asiatica L.）和平车前（Plantago depressa Willd.）两种。中医学认为：车前草性甘、寒，归肝、肺、膀胱经，有利尿通淋、清肝明目、镇咳祛痰的作用。现代中药药物学的研究表明，车前草含有多种化学成分，如多糖类、黄酮及其苷类、环烯醚萜类以及挥发油类等成分，其中，车前草多糖类成分中含有L-阿拉伯糖（20%）、D-半乳糖（28%）、D-葡萄糖（6%）、D-甘露糖（2%）、L-鼠李糖（4%）、D-葡萄糖酸（31%）及少量D-木糖和炭藻糖，其多糖成分与黄芪多糖相似。而黄芪在我国的产区较少，产量有限，但需求很大，如果能发现与黄芪多糖作用相似、而资源丰富、价格低廉的中药多糖必然具有巨大开发前景。

一些研究发现，车前草具有抗炎、抗氧化作用、抗病原微生物的作用，以及有抗抑郁、抗肿瘤、镇痛等多种药理作用[9]。但目前，关于车前草的药理、毒理作用等方面的研究较少，车前草对机体免疫方面的研究尚未见有文献资料。本试验进行了车前草多糖对新城疫疫苗免疫雏鸡的血清抗体效价和T淋巴细胞增值率影响的研究，并与黄芪多糖、铝胶佐剂对新城疫疫苗的免疫效果进行比较，结果显示，车前草多糖能显著提高鸡抗体效价、增强淋巴细胞增值，与黄芪多糖无显著性差异（P>0.05），且车前草多糖提高抗体效价作用较黄芪多糖和铝胶盐佐剂维持时间较

长。这表明，车前草多糖能有效维持并提高雏鸡的抗体效价和T淋巴细胞增殖水平，并能显著刺激雏鸡的红细胞和白细胞的生成，以及显著提高雏鸡胸腺、脾脏、腔上囊的免疫器官指数[10]。

志谢：对中国动物疫病防御控制中心，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，甘孜州和阿坝州动物疫病预防控制中心，若尔盖和理塘县动物疫病预防控制中心相关工作人员给予本课题研究工作的支持和帮助。

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Effects of Plantain Polysaccharideon Newcastlediseasevaccinein chicken

CHEN Jia-lei，LIU Shi-qi，FENG Jun，ZHENG Ye-long，NIE Kui
（College of animal science and technology，Southwest University，Chongqing 400715，China）

Abstract：The effect of Plantain polysaccharide on Newcastle disease vaccine in chicken was evaluated .In our study，three hundred and fifty 8 day-old chickens were randomly divided into seven groups and each group was vaccinated with NDV at age of 8 and 22 day old respectively.On days 7 and 14 after first vaccination and on days 7，14 and 21 after second vaccination，3 chick⁃en from each group were bled for determination of serum ND-HI antibody titer and the proliferation of peripheral T lymphocyte . Ten chickens in each group were challenged by Newcastle disease virus on day 21 after second vaccination.The results showed that the ND-HI titer and the proliferation of peripheral T lymphocyte in Plantain polysaccharide+NDV group were significantly higher than that in control group.Our data suggest that Plantain polysaccharid can significantly enhance the ND-HI titer when compared with Astragalus polysaccharide and Alhydrogel adjuvant.

Key words：Plantain polysaccharide；New castle disease vaccine；T lymphocyte；Antibody；Chickens

通讯作者：聂奎，E-mail：niekui0123@126.com

作者简介：陈家磊（1992-），男，硕士生，从事兽医微生物与免疫学的研究，E-mail：592271024@qq.com

基金项目：教育部国家级大学生创新创业训练计划（201210-635014）；重庆市科委重点攻关项目（CSTC，2011AB2030）

收稿日期：2014-05-15

中图分类号：S852.65+9.5

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2015）10- 0050- 03