阿托伐他汀缓解百草枯中毒大鼠肺纤维化机制的研究

龚晓亮，樊菲菲，王彦军，黄　杨，尹　文



阿托伐他汀缓解百草枯中毒大鼠肺纤维化机制的研究

龚晓亮，樊菲菲，王彦军，黄杨，尹文

[摘要]目的观察阿托伐他汀对百草枯中毒所致肺纤维化疗效，并探讨其可能的作用机制。方法取健康成年SD大鼠120只，随机分为生理盐水组和百草枯组，每组10只，百草枯+阿托伐他汀10、20、40 mg组(实验1、2、3组)，百草枯+阿托伐他汀40 mg+吡格列酮组(PLZ组)和百枯草+阿托伐他汀40 mg+GW9662组(GW9662组)，每组20只。百草枯肺间质纤维化模型以百草枯溶液3.5 mg/kg的剂量腹腔注射制备，生理盐水组则以等体积的生理盐水腹腔注射，其余各药物干预组均在建立百草枯模型的基础上给予相应的药物，连续给药14 d后处死大鼠，比较各组大鼠肺泡灌洗液中炎性细胞数目、肺组织中羟脯氨酸、血清中转化生长因子(TGF)-β1的含量。结果肺泡灌洗液中炎性细胞数目、肺组织中羟脯氨酸、血清中TGF-β1的含量百草枯组均高于生理盐水组，实验2、3组均低于百草枯组(P<0.05，P<0.01)。GW9662组肺泡灌洗液中炎性细胞数目和肺组织中羟脯氨酸低于实验3组，PLZ组高于实验3组(P<0.05，P<0.01)。GW9662组和PLZ组血清中TGF-β1的含量均高于实验3组，但PLZ组升高更明显(P<0.05，P<0.01)。结论阿托伐他汀可缓解百草枯中毒所致的肺纤维化，且呈剂量依赖的方式，其作用机制可能是通过PPARγ途径而实现。

[关键词]百草枯；中毒；肺纤维化；阿托伐他汀；吡格列酮；GW9662；PPARγ；大鼠，Sprague-Dawley

百草枯是目前使用最广泛的速效触杀型除草剂[1]。由于百草枯中毒机制尚未完全清楚，故缺乏特异性的解毒剂。有报道，常规清除毒素、血液净化、清除氧自由基、免疫抑制剂联合治疗后致死率仍为25%～80%[2]。百草枯所致肺组织损伤机制目前并不完全清楚，但百草枯在结构方面类似于内生性多胺，易被肺组织及气管主动摄取，在肺部蓄积[3-5]，从而导致肺间质纤维化及呼吸衰竭。所以，明确百草枯中毒后肺间质纤维化发生的机制，将成为百草枯中毒救治的关键。有学者研究表明，肺间质纤维化与各种炎性因子的浸润和氧化应激相关[6-7]。阿托伐他汀已在动物实验方面证实了其可通过作用于A羟甲基戊二酰辅酶A(HMG CoA)还原酶而发挥抗炎及抗纤维化作用[8-9]，故我们设计本实验以验证阿托伐他汀是否具有缓解百草枯中毒所致的肺纤维化的作用，并探讨其可能的作用机制。

1材料与方法

1.1实验动物及分组选用健康成年SD大鼠120只，体重(250±50)g，由第四军医大学动物实验中心提供。实验前大鼠禁食12 h，可自由活动及饮水。随机分为生理盐水组和百草枯组各10只，百草枯+阿托伐他汀10、20、40 mg组(实验1、2、3组)，每组20只，百枯草+阿托伐他汀40 mg+吡格列酮组(PLZ组)和百枯草+阿托伐他汀40 mg+GW9662组(GW9662组)各20只，2 d称重大鼠1次，根据大鼠体重调整进食水及用药剂量。

1.2主要仪器和试剂流式细胞仪(美国BD公司FACSAria产品)，双光束紫外分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)，羟脯氨酸检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；转化生长因子(TGF)-β1(1∶200)蛋白兔抗人多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司)，SP检测试剂盒(北京中杉金桥公司)，百草枯溶液(北京华都生物科技有限公司)，阿托伐他汀(大连辉瑞制药有限公司)，吡格列酮(Sigma-Aldrich公司)，GW9662(Tocris bioscience公司)。

1.3模型制备百草枯肺间质纤维化模型以百草枯溶液3.5 mg/kg的剂量腹腔注射制备，生理盐水组则以等体积的生理盐水腹腔注射，其余各药物干预组均在建立百草枯模型的基础上给予相应的药物处理。实验组给予不同剂量阿托伐他汀水溶液灌胃，PLZ组和GW9662组分别于腹腔注射吡格列酮10 mg/kg和GW9662 1 mg/kg[10]，所有药物每日给药1次，给药14 d后处死所有大鼠。

1.4观察指标

1.4.1肺泡灌洗液中炎性细胞的收集：用25%的乌拉坦麻醉处死大鼠，分离气管和双肺，切开气管插入塑料管，用15 ml生理盐水反复灌洗肺泡，纱布过滤后收集灌洗液，取相同体积的灌洗液，计数中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、巨噬细胞数量。

1.4.2肺组织中羟脯氨酸水平的测定：肺组织标本溶解在氯化钾溶液(pH=7.4)150 ml中，混合物用来测量羟脯氨酸含量，0.5 ml的标本溶解在6 mol/L的氯化钾溶液1 ml中，130℃，水解5 h，然后用NaOH调节混合液pH为6.5～7.0，加入双蒸水至30 ml，摇匀后取样品1 ml和0.05 mol/L氯胺T 1.0 ml混合，室温孵育20 min，然后加入20%的二甲苯1 ml溶解，混合物在60℃孵育20 min，最后用分光光度计测量样品在550 nm处的吸光度值，与试剂盒中羟脯氨酸标准品对应的吸光度值比较，计算出各组大鼠肺组织中羟脯氨酸含量。

1.4.3血清中TGF-β1的测定：大鼠左心室采血1 ml，将标本酸化后与标准品混合，加入被抗人TGF-β1单抗包被的酶标板上，室温放置2 h，PBS洗涤4次，加入生物素化的抗人TGF-β1抗体，室温放置2 h，PBS洗涤4次，加入酶标抗体30 min，PBS洗涤4次，加入底物A、B液显色5～15 min，加入终止液，酶标仪450 nm比色，与标准品对应的比色值比较，计算出各组血清中TGF-β1含量。

2结果

2.1肺泡灌洗液中炎性细胞含量肺泡灌洗液中炎性细胞含量百草枯组均高于生理盐水组(P<0.01)，实验1组与百草枯组比较差异无统计学意义(P>0.05)，实验2、3组均低于百草枯组，GW9662组低于实验3组，PLZ组高于实验3组(P<0.05，P<0.01)。见表1。

2.2肺组织中羟脯氨酸的含量肺组织中羟脯氨酸含量生理盐水组、百草枯组、实验1、2、3组、GW9662组和PLZ组分别为(1.7±0.1)、(5.9±0.3)、(4.8±0.8)、(4.5±0.3)、(3.2±0.1)、(2.2±0.4)和(4.1±0.9)mg/g，百草枯组含量高于生理盐水组(P<0.05)，实验1组与百草枯组比较差异无统计学意义(P>0.05)，实验2、3组低于百草枯组(P<0.05，P<0.01)，GW9662组低于实验3组，PLZ组高于实验3组(P<0.05)。

表1　各组大鼠肺泡灌洗液中炎性细胞的数目(×106/L)

注：实验1、2、3组分别给予阿托伐他汀10、20、40 mg, GW9662组为百枯草+阿托伐他汀40 mg+GW9662组，PLZ组为百枯草+阿托伐他汀40 mg+吡格列酮组；与生理盐水组比较，bP<0.01；与百草枯组比较，aP<0.05，dP<0.01；与实验3组比较，cP<0.05，fP<0.01

2.3血清TGF-β1的含量血清TGF-β1的含量生理盐水组、百草枯组、实验1、2、3组、GW9662组和PLZ组分别为(4.5±1.1)、(21.5±5.7)、(18.2±6.2)、(11.3±2.6)、(3.2±0.1)、(6.1±2.5)和(9.8±2.5)ρB/(ng·ml)，百草枯组含量高于生理盐水组(P<0.05)，实验1组与百草枯组比较差异无统计学意义(P>0.05)，实验2、3组低于百草枯组(P<0.05，P<0.01)，GW9662组和PLZ组均高于实验3组，但PLZ组升高更明显(P<0.05，P<0.01)。

3讨论

本研究结果发现，经过14 d百草枯处理后的大鼠出现了肺间质纤维化及炎性细胞的浸润，与以往研究结果相符[10-11]。百草枯可诱导肺间质纤维化，但其确切的分子机制及细胞内作用位点并不清楚，有学者研究表明其机制可能是过氧化应激负荷的加重[6]，也有学者研究表明，百草枯可通过消耗硫醇分子而使细胞内抗氧化分子减少，从而削弱细胞的抗氧化能力[7]。肺间质纤维化最主要的病理学改变是细胞外基质的增多和肺泡间结缔组织的增生、重建，细胞外基质中含有丰富的Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白。已有研究结果表明，羟脯氨酸在其他胶原蛋白中的含量约1%，而在Ⅳ型胶原蛋白中含量高达13%[12]，故羟脯氨酸的含量可间接反映肺纤维化的水平，而在本实验中也发现了经百草枯诱导后其含量显著升高，经阿托伐他汀干预后其含量下降。TGF-β1是被公认的最关键的导致纤维化的炎性因子[13-14]。TGF-β1可能通过增加成纤维细胞及细胞外基质的蓄积而产生炎性作用，成纤维细胞及细胞外基质的增多，可能导致间质纤维化的产生及恶化，故TGF-β1也可作为肺纤维化的一个指标。本研究结果显示，百草枯组血清TGF-β1的含量显著高于生理盐水组，而阿托伐他汀20、40 mg干预后，其含量较百草枯组显著下降。

近年来研究表明，PPARs在动脉粥样硬化等炎性反应中起重要作用[9]，而PPARs，尤其是PPARγ作为近年来炎性反应研究的热点，在肺部慢性炎性疾病中也起重要作用，PPARγ和PPARα的配体可减少炎性细胞的募集、细胞外基质的产生及胶原蛋白的降解[15-16]。既往研究结果显示，阿托伐他汀具有抗炎、抗纤维化和抑制细胞外基质聚集及促进其分解等作用[17]。已知吡格列酮是PPARγ的激活剂，GW9662是PPARγ的抑制剂，可抑制PPARγ的活性。本研究结果表明，实验2、3组中炎性细胞数量、肺纤维化的指标均明显下降，而实验3组下降更明显；GW9662组炎性细胞数量和羟脯氨酸低于实验3组，PLZ组均高于实验3组，GW9662组和PLZ组TGF-β1均高于实验3组，但PLZ组升高更明显，因此，本实验谨慎得出，阿托伐他汀可缓解百草枯中毒所致的肺纤维化，而加入PPARγ抑制剂GW9662后可使这种保护作用放大，加入PPARγ激活剂后可部分逆转这种保护作用，继而推断出阿托伐他汀对百草枯中毒所致肺纤维化的保护作用可能是通过PPARγ途径实现的。

综上所述，阿托伐他汀对百草枯中毒所致肺纤维化的保护作用呈剂量依赖性，抑制PPARγ途径可增强阿托伐他汀对肺纤维化的保护作用，而激活PPARγ途径可能降低阿托伐他汀对肺纤维化的保护作用。阿托伐他汀是治疗百草枯中毒所致肺纤维化极有前景的药物，其是否能最终在临床得以推广，目前仍缺乏临床数据的验证，而其他他汀类药物是否具有相同的保护作用亦有待验证。

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(收稿时间：2014-12-16修回时间：2015-01-27)

基础研究

·论著·

A Mechanisms Study on Atorvastatin in Alleviation of Pulmonary Fibrosis Rats with Paraquat Poisoning

GONG Xiao-liang, FAN Fei-fei, WANG Yan-jun, HUANG Yang, YIN Wen (Emergency Department, Xijing Hospital of the Fourth Military Medical University of PLA, Xi'an 710032, China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the curative effects of Atorvastatin on Paraquat (PQ)-induced pulmonary fibrosis and to explore the possible mechanisms. MethodsA total of 120 healthy adult SD rats were randomly divided into normal saline group (n=10), PQ poisoned group (n=10), PQ and Atorvastatin at the dose of 10, 20 or 40 mg groups (experiment group 1, 2 and 3,n=20 for each group), PQ, Atorvastatin at the dose of 40mg and Pioglitazone group (PLZ group,n=20) and PQ, Atorvastatin at the dose of 40mg and GW9662 group (GW9662 group,n=20). The PQ-induced pulmonary fibrosis models were established with 3.5 mg/kg PQ solutions by intraperitoneal injection, and the models of normal saline group were established with the same volume of normal saline by intraperitoneal injection. All the drug intervention groups were given corresponding drugs after the establishment of PQ models, and all the SD rats were sacrificed at the 14thd of continous administration, and then the amount of inflammatory cells in alveolar lavage fluid, the content of hydroxyproline in lung tissues and the content of serum TGF-β1(transforming growth factor-β1) among all groups were compared. ResultsThe values of amount of inflammatory cells in alveolar lavage fluid, the content of hydroxyproline in lung tissues and the content of serum TGF-β1in PQ poisoned group were significantly higher than those in normal saline group, and the values in experiment group 2 and 3 were less significant than those in PQ group (P<0.05，P<0.01). The values of amount of inflammatory cells in alveolar lavage fluid and the content of hydroxyproline in lung tissues in GW9662 group were less significant than those in experiment group 3, while the values in PLZ group were significantly higher than those in experiment group 3 (P<0.05，P<0.01). The values of serum TGF-β1content in PLZ group and GW9662 were significantly higher than that in experiment group 3, but the increased value was more obvious in PLZ group (P<0.05，P<0.01). ConclusionAtorvastatin can alleviate the PQ-induced pulmonary fibrosis with a dose-dependent manner, and the mechanisms may be achieved through PPARγ.

[Key words]Paraquat； Poisoning; Pulmonary fibrosis; Atorvastatin; Pioglitazone; GW9662; PPAR gamma; Rats, Sprague-Dawley

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.05.007

[文献标志码][中国图书资料分类号]R595.5A

[文章编号]2095-140X(2015)05-0023-03

[通讯作者]尹文，E-mail：xjyyyw@fmmu.edu.cn

[基金项目][作者单位]710032 西安，第四军医大学西京医院急诊科