DC-CIK治疗难治性多发性骨髓瘤的临床研究

徐　源

作者单位：250062 山东省济南大学医学科学院医学与生命科学学院；272011 山东省济宁市第一人民医院

DC-CIK治疗难治性多发性骨髓瘤的临床研究

徐源

作者单位：250062 山东省济南大学医学科学院医学与生命科学学院；272011 山东省济宁市第一人民医院

【摘要】目的探讨树突状细胞(DC)和细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)治疗难治性多发性骨髓瘤的疗效和安全性。方法41例难治性多发性骨髓瘤患者，根据患者意愿分为22例实验组和19例对照组。将实验组自体DC-CIK细胞进行体外扩增，再过继回输进行治疗。对照组患者接受维持治疗。对过继治疗前后患者的免疫指标以及临床疗效进行对比和观察。结果诱导后CD表面CD1a、CD83、CD86和HLA-DR分子阳性率均较诱导前显著提高，差异有统计学意义(P<0.01)。诱导后DC-CIK表面CD3、CD8和CD56阳性率均较CIK有显著提高，差异有统计学意义(P<0.01)。治疗3个月后，实验组患者QOL、Ag-NOR和外周血IL-12等指标均较对照组有显著优化，差异有统计学意义(P<0.05)。3个月治疗后，实验组患者肾功能、24 h 尿液轻链、血清M 蛋白、β2-M、骨髓瘤细胞比例均相较对照组有显著改善，差异有统计学意义(P<0.05)。结论DC-CIK过继治疗难治性MM具有较好的临床疗效，可帮助患者带瘤长期生存，获得较大受益。

【关键词】细胞因子诱导的杀伤细胞 ；树突状细胞；多发性骨髓瘤；过继治疗

Clinical Study of DC-CIK for Refractory Multiple Myeloma

XUYuan.CollegeofMedicineandLifeScience，JinanUniversity，Jinan，250062

【Abstract】ObjectiveTo explore the clinical efficacy and security of dendritic cells(DC) and cytokine induced killers(CIK) in the treatment of refractory multiple myeloma (MM).Methods41 patients with refractory MM were divided into the experimental group and the control group according to their willings，there were 22 cases in the experimental group and 19 cases in the control group.The autologous DC-CIK cells were amplificated in vitro and then for reinfusion treatment.The control group received maintenance therapy.The immune parameters and clinical effects before and after treatment were compared and observed.ResultsAfter induction，the positive rates of CD1a，CD83，CD86 and HLA-DR molecules on CD surface improved significantly，the difference was statistically significant (P<0.01).After induction，the positive rates of CD3，CD8 and CD56 molecules on CD-CIK surface improved significantly than those of CIK，the difference was statistically significant (P<0.01).After 3 months of treatment，The QOL，Ag-NOR and peripheral IL-12 of patients in the experimental group were all significantly optimized compared to the control group，the difference was statistically significant (P<0.05).After 3 months of treatment，the renal function，urine light chain，serum M protein，β2-M and the proportion of myeloma cells were significantly improved compared to the control group，the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionDC-CIK for refractory MM has good clinical effect，it can improve long-term survival of patients with tumors with large benefit.

【Key words】Cytokine-induced killer cells；Dendritic cells；Multiple myeloma；Adoptive therapy

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:0454～0456)

多发性的骨髓瘤(multiple myeloma，MM)为来自浆细胞的一类恶性肿瘤，具有较高发病率，大约占到恶性肿瘤总数的1%，占到恶性血液肿瘤总数的10%左右，而且发病率会随年龄增长不断增高，此外骨髓瘤病人治疗后易反复，预后差，当前还不能完全治愈[1]。目前对于难治性MM还没有一个有效统一的方案。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killers，CIK)是将人骨髓或外周血的单个核细胞于体外培养所得的一类异质性的细胞，其具备T淋巴细胞的抗肿瘤的活性外，还具有非MHC限制性的杀瘤能力，杀伤活性据报道可达84.7%[2]。树突状细胞(dendritic cells，DC)为人体内专职进行抗原呈递最有效的细胞。通过携带肿瘤抗原DC施行免疫治疗，可以刺激患者机体发生特异性的T细胞免疫反应。本研究自2009年3月-2014年3月间于对22例难治性MM患者进行DC-CIK过继治疗，临床疗效较好，具体报告如下。

1资料与方法

1.1　一般资料

实验组22例患者包括13例男性，8例女性，年龄为44～81岁，中位年龄57岁，临床分型：11例IgG型，4例IgA型，2例IgD型，4例λ链型，1例κ链型。DurieSalmon分期：5例Ⅱ期，17例Ⅲ期；对照组19例患者包括11例男性，8例女性，年龄为42～83岁，中位年龄55岁，临床分型：13例IgG型，2例IgA型，1例IgD型，2例λ链型，1例κ链型。DurieSalmon分期：4例Ⅱ期，15例Ⅲ期。两组患者的年龄、性别、分期等一般情况比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2　纳入标准[3]

① 均经病理检查诊断为MM；②均经TD(地塞米松+沙利度胺)、DVD(地塞米松+长春新碱+脂质体的阿霉素)、PAD(地塞米松+阿霉素+硼替佐米) 等方案治疗后发展为难治性MM。③患者知情后，同意接受DC-CIK治疗者进入实验组，并签署知情同意书，不同意者进入对照组。

1.3　排除标准

①有禁忌症患者；②化疗仍可受益者；③情况非常差或处于临终状态。

1.4　材料与试剂

酶标仪Elx800 Bio-Tek、流式细胞仪购自BD公司；由FITC标记的CD3、CD8、CD56、CD83、HLA以及CD86单克隆抗体(mAb)，PE标记的HLA ⅡmAb、CD56，IL-1α、IL-2、TNF-α、rhIL-4、rhGM-CSF和RPMI 1640培养液购自Hyclone公司；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒和IL-12、IFN-γ ELISA检测试剂盒购自Roche公司；淋巴细胞的分离液购自上海第二制药厂；银染液、固定液、细胞的低渗液等相关配套试剂和免疫图像的分析系统，均购自北京健尔康医疗设备有限公司。

1.5　治疗方法

1.5.1DC-CIK的诱导首先参考文献[4]取得实验组患者外周血中单个的核细胞(PBMC)，1.0×1010~5.0×1010，孵箱中进行2 h贴壁，将悬浮细胞抽取(细胞数为1×106/ml)后加入到含有IL-1(100 U/ml)、IL-2(500 U/ml)、CD3 mAb(100 ng/ml)、IFN-γ(1 000 U/ml)的1640液中，进行CIK培养，每46 h将培养液更换一次，于第7 d进行收集。剩余贴壁细胞加入IL-4和GM-CSF(最终浓度是125 ng/ml)，新鲜因子每3 d补充一次，第6 d加入5 μg/ml(终浓度)自体Ag(Ag-DC)。取培养到第8 d的Ag-DC和PBMC，分别加入10 μl FITC标记的CD86 mAb、CD83 mAb及10 μl PE标记的HLA ⅡmAb，通过流式细胞仪进行测定。将收集到的CIK培养液分为2组，其中1组为单纯CIK培养液，另外1组把Ag-DC和CIK按照1∶10的比例进行共同培养(Ag-DC-CIK)。分组后继续培养24 h，取培养第8 d的Ag-DC-CIK、CIK和PBMC，加入FITC标记mAb对CD3表达进行检测，加入PE标记mAb对CD8、CD56进行检查。于培养第7 d把Ag和CIK按照1∶10的比例共同培养。

1.5.2细胞回输于每次治疗之前48 h，对CIK和DC进行内霉素、真菌和细菌检测，确认无污染之后，在培养第14 d，把Ag-DC致敏的CIK细胞进行离心和洗涤，通过20万单位的rhIL-2、25 ml的人血白蛋白及100 ml的生理盐水重悬细胞，并于2 h捏回输至患者的体内，在回输之前给患者肌注25 mg非那根。

1.5.3细胞的免疫表型分析培养第8 d抗原负载DC，将CD1a、CD86、HLA-DR、CD83、CD80mAb分别加入，通过流式细胞仪对成熟前后DC免疫表型进行检测。将培养第14 d的DC-CIK和单独CIK细胞进行收集，FITC标记的CD8、CD56和CD3mAb分别加入，通过流式细胞仪对免疫表型进行检测。

1.6　疗效评价[5]

治疗前与治疗之后6个月患者生活治疗(QOL)通过PS(Performance Status)评分法(5分法)进行评分；对连续24 h内收集尿液的轻链含量、骨髓瘤浆细胞的百分数、β2微球蛋白(β2-M)、尿素氮(BUN)和血清肌酐(Scr)的水平进行记录。疗效评定标准参照欧洲血液和骨髓移植协作组(EBMT)制定的标准，包括疾病进展(PD)、轻微反应(MR)、部分缓解(PR)、接近的完全缓解(nCR)和完全缓解(CR)。两组患者PBMC于相同时间进行分离和银染，通过KL系统对淋巴细胞的银染区和核面积比例(IS%)进行计算。

1.7　不良反应评价[6]

不良事件参照CTCAE(common terminology criteria for adverse events，美国国立癌症研究所制定)制定的标准记录。

1.8　统计学处理

研究数据的统计分析采用SPSS 17.0统计分析软件，计数资料之间采用卡方检验进行比较分析，使用t检验比较分析计量资料之间的差异，统计结果以P<0.05表示有显著性差异。

2结果

2.1　诱导前后DC的免疫表型比较(表1)

诱导之后CD表面CD1a、CD83、CD86和HLA-DR分子阳性率均较诱导前有显著提高，差异有统计学意义(P<0.01)。

表1　诱导前后DC的免疫表型比较

2.2　培养前后DC-CIK 细胞细胞表型表达水平比较

诱导后DC-CIK表面CD3，CD8和CD56阳性率均较CIK有显著提高，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2　培养前后DC-CIK 细胞的细胞表型

2.3　2组患者QOL及免疫学的指标对比

治疗3个月后，实验组患者QOL、Ag-NOR和外周血IL-12等指标均较对照组有显著优化，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3　两组患者QOL及免疫学的指标对比±s)

注：*为两组治疗后相比，χ2=17.0015，P<0.05。

2.4　治疗前后两组患者病情的评估指标对比

治疗3个月后，实验组患者肾功能、24 h 尿液轻链、血清M 蛋白、β2-M、骨髓瘤细胞比例均较对照组有显著改善，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

3讨论

MM 为浆细胞恶性疾病，至今仍无法治愈。新一代的药物硼替佐米可以提高患者生存期，然而其副反应以及高昂费用使其应用受到了极大限制，仍然需要对有效治疗方案进行探索。细胞免疫过继疗法(adoptive cellular immunotherapy，ACI)通过向肿瘤患者输入非特异性活特异性的能够对肿瘤细胞产生抑制作用的效应免疫细胞，对肿瘤细胞直接杀伤或者对患者自身免疫反应进行诱发从而达到抑制乃至治疗肿瘤目的[7]。

表4　治疗前后两组患者病情的评估指标对比

注：*为两组治疗后比较，χ2=17.0822，P<0.05。

CIK为具有最高杀伤活性的体内效应细胞。可以对CD3+，CD56+同时表达，具有T细胞的特异性免疫能力外，同时具备NK细胞的非MHC限制性免疫能力，可以高效精确地对癌细胞进行杀伤而不对正常细胞造成损伤，其杀伤活性约是LAK细胞50倍。CIK细胞优势包括高杀瘤活性、高增殖速度、杀瘤和抗凋亡效应免于癌细胞多药耐药影响等。DC为抗原的呈递细胞中功能最强的一类，在受到Ag刺激之后，活化状态DC可为CIK提供有效启动信号，从而对MM泛特异性的杀伤进行诱导。Ag刺激的CIK可以对瘤细胞进行主动识别，其相较单纯的CIK杀伤活性有显著提高，可以明显降低肿瘤的逃逸率。本研究结果，联合培养DC与CIK后，CD3、CD8和CD56阳性率均有显著提高，差异有统计学意义(P<0.01)。

当前，已有报道通过肿瘤的裂解物对DC免疫致敏以治疗转移性晚期实体肿瘤，并取得了一定临床疗效，然而使用DC-CIK用于MM治疗的临床研究报道仍较少。DC-CIK用于MM治疗具有下列优势：①可对隐匿的瘤细胞进行反复杀伤和清除；②可通过细胞因子的分泌以激活免疫抗瘤；③可使器官功能得到改善，使化疗的不良反应得到缓解；④不会损伤正常组

织[8]。本研究中实验组患者接受DC-CIK的过继治疗之后，其QOL及24 h尿液轻链、β2-M、血清M蛋白、瘤细胞的百分比、肾功能相较于治疗前均有显著改善，差异有统计学意义(P<0.05)。此外患者外周血的淋巴细胞Ag-NOR IS值提高显著，表明细胞治疗使患者淋巴细胞的活性得到了增强，使其机体的抗瘤能力得到了增强，最终提高了MM近期的治疗效果。本研究中患者接受DC-CIK过继治疗后仅个别出现短暂低热、畏寒，症状在处理后缓解，没有其他的不良反应。综上所述，DC-CIK过继治疗难治性MM具有较好临床疗效，可帮助患者带瘤长期生存，获得较大受益。

参考文献

[1]孙薏，匡红，张小玉，等.DC-CIK 过继免疫联合沙利度胺治疗复发难治性多发性骨髓瘤的回顾性研究〔J〕.免疫学杂志，2012，28(4)：324-328.

[2]钟国成，颜斌，孙薏，等.DC-CIK 过继免疫联合化疗治疗多发性骨髓瘤的疗效分析〔J〕.中华血液学杂志，2012，33(12)：1000-1003.

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[5]周仲昊，王智.蛋白酶体抑制剂治疗多发性骨髓瘤临床观察〔J〕.中华全科医学，2012，11(3)：1739-1740.

[6]王娟，陶贞霞，刘荣英，等.DC-CIK细胞免疫治疗恶性肿瘤的临床研究〔J〕.免疫学杂志，2009，25(1)：71-74.

[7]Su X，Zhhang L，Jin L，et al.Coculturing dendritic cells with zoledronate acid efficiently enhance the antitumor effects of cytokine induced killer cells〔J〕.J Clin immuol，2010，30(5)：766-774.

[8]Wang J，He M，Shi W，et al.Inducible costimulator(ICOS)enhances the cytolytic activity of cytokine induced killer cells against gallb ladder cancer in vitro and in vivo〔J〕.Cancer Invest，2009，27(3)：244 - 250.

(编辑：吴小红)

(收稿日期2014-09-09修回日期 2014-12-15)

中图分类号：R733.3

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2015)03-0454-03

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.03.044