苦参碱及联合顺铂对宫颈癌SiHa细胞中TSLC1基因表达的影响

王　蕾　王纯雁

作者单位：110042 辽宁省肿瘤医院妇科

苦参碱及联合顺铂对宫颈癌SiHa细胞中TSLC1基因表达的影响

王蕾王纯雁

作者单位：110042 辽宁省肿瘤医院妇科

【摘要】目的探讨苦参碱及联合顺铂对宫颈癌SiHa细胞中TSLC1基因表达的影响。方法以人宫颈癌细胞株SiHa细胞株为试验材料，采取甲基偶氮唑蓝法检测并计算细胞抑制率。采取实时荧光逆转录聚合酶联反应法分析TSLC1 mRNA基因表达情况。结果顺铂、苦参碱联合顺铂均可显著抑制SiHa细胞体外增殖，差异具有统计学意义(P<0.05)；随着用药浓度的增加，抑制作用增强，不同浓度两两比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；联合组细胞抑制率高于苦参组、顺铂组，差异具有统计学意义(P<0.05)。三组用药后，TSLC1基因表达水平均高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)；随着浓度的增加，影响效果更强，组间不同浓度两两比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；联合组高于顺铂组、苦参碱组，同浓度比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；顺铂组与苦参碱组同浓度比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论苦参碱及联合顺铂对宫颈癌SiHa细胞中TSLC1基因表达有抑制作用，且与药物浓度呈剂量依赖性。

【关键词】苦参碱；顺铂；宫颈癌；SiHa细胞；TSLC1基因

Effects of Matrine Combined with Cisplatin on the Expression of TSLC1 Gene in Human Cervical Cancer SiHa Cell

WANGlei，WANGChunyan.LiaoningTumorHospital，Shenyang，110042

【Abstract】ObjectiveTo explore the effects of matrine combined with cisplatin on the expression of TSLC1 gene in human cervical cancer SiHa cell.MethodsHuman cervical cancer SiHa cell were selected as the experimental material，the inhibition rate was tested by MTT，the expression of TSLC1 gene were tested by RT-PCR.ResultsThe matrine combined with cisplatin can inhibit proliferation of SiHa cell in vitro(P<0.05)；The inhibitory effect in high concentration was higher than that of the lower concentration(P<0.05)；The inhibition rate of the combined group was higher than matrine group and cisplatin group(P<0.05)；The TSLC1 gene expression of the 3 groups was higher than that of the control group(P<0.05)；The inhibitory effect in high concentration were higher than that of the lower concentration(P<0.05)；The combined group was higher than the matrine group and cisplatin group(P<0.05)；There was no significant difference between matrine group and cisplatin group(P>0.05).ConclusionMatrine combined with cisplatin has inhibitory effect on the expression of TSLC1 gene in human cervical cancer SiHa Cell，and the effect is dose dependent.

【Key words】Matrine；Cisplatin；Cervical cancer；SiHa Cell；TSLC1 Gene

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:0326～0328)

宫颈癌临床发病率较高，是仅次于乳腺癌的妇科恶性肿瘤，死亡率居女性恶性肿瘤之首，严重威胁女性健康[1]。现代分子生物学研究表明，宫颈癌的发生和发展受多因素、多阶段、多基因共同影响，其中癌基因激活、抑癌基因失活以及抑癌基因表达下降或缺失所引起的细胞异常增生和凋亡失控是引发癌症的主要危险因素[2]。因此，研究与宫颈癌发生和发展密切相关的各种抑癌基因及其与治疗药物之间的关系对宫颈癌的临床治疗具有重要意义。现对苦参碱及联合顺铂对宫颈癌SiHa细胞中TSLC1基因表达的影响情况进行分析，以期为临床治疗提供参考，报告如下。

1材料与方法

1.1　材料

人宫颈癌细胞株：SiHa细胞株(兰州大学基础医学院中心实验室提供)在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养。

1.2　主要试剂及仪器

试剂：RPMI-1640培养基(购于美国Gibco公司)；FBS(购自杭州四季青公司)；DMSO(购自北京索莱宝科技有限公司)；胰蛋白酶(购自美国Sigma公司)；MTT(购自美国Amresco)公司。

仪器：超净工作台；显微镜；酶标分析仪；电子天平；恒温水浴箱；离心机；震荡仪；移液器。

1.3　方法

MTT(甲基偶氮唑蓝)法：选取对数生长期SiHa细胞，经胰蛋白酶消化后，制备细胞悬液；37℃下CO2培养箱中培养，贴壁完成后，分别加入不同浓度的顺铂，做6个平行孔。苦参碱浓度为：0 μg/ml(对照)，50 μg/ml(浓度1)，100 μg/ml(浓度2)，150 μg/ml(浓度3)，200 μg/ml(浓度4)，250 μg/ml(浓度5)；顺铂浓度为：0 μg/ml(对照)，5 μg/ml(浓度1)，10 μg/ml(浓度2)，15 μg/ml(浓度3)，20 μg/ml(浓度4)，25 μg/ml(浓度5)；苦参碱联合顺铂浓度为：苦参碱0 μg/ml(对照)、50 μg/ml(浓度1)、100 μg/ml(浓度2)、150 μg/ml(浓度3)、200 μg/ml(浓度4)、250 μg/ml(浓度5)，分别联合15 μg/ml顺铂。同样，选取细胞后，培养，贴壁完成，分别加入不同浓度的苦参，做6个平行孔。在上述条件下对细胞进行进一步培养，48 h后观察细胞形态。加入MTT10 μL，继续培养4 h；吸去培养液，加入DMSO终止反应；测定吸光值。计算细胞抑制率。

RT-PCR(实时荧光逆转录聚合酶联反应)法[3]：选取MTT结果中最佳抑制率对应的时间为联合组，其他为苦参碱组(加入不同浓度苦参碱)、顺铂组(加入不同浓度顺铂)，选择未经顺铂和苦参碱处理的SiHa细胞为对照组。基本原理：在PCR反应体系中，加入过量的荧光染料后，使其和双链DNA特异性结合，进而发出荧光信号，判断扩增结果。具体方法：设计引物；RNA提取；cDNA(反转录NDA)的合成；RT-PCR反应。

1.4　结果判断

细胞体外增殖情况：采取酶联免疫检测仪OD490nm处测定吸光值。对照组细胞体外生长状态良好，以其细胞活力为100%，计算不同浓度顺铂对细胞体外增殖的影响(抑制率)[4]。

TSLC1 mRNA基因表达情况：根据循环后的荧光信号，得到不同组间的TSLC1 mRNA基因相对表达量。

1.5　统计学分析

2结果

2.1　苦参碱联合顺铂对SiHa细胞体外增殖的影响

苦参碱联合顺铂对SiHa细胞体外增殖的影响见表1。结果表明，对照组细胞生长良好，增殖效果明显；联合组、苦参碱组、顺铂组细胞生长状态不佳，多死亡，苦参碱、顺铂、苦参碱联合顺铂均可显著抑制SiHa细胞体外增殖，差异具有统计学意义(P<0.05)；随着用药浓度的增加，抑制作用增强，组间不同浓度两两比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；联合组细胞抑制率高于苦参组、顺铂组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1　不同浓度苦参碱、顺铂及苦参碱联合顺铂对SiHa细胞体外增殖的抑制情况 /%

注：a为与同组前一个浓度比较，P<0.05；b为与苦参碱组比较，P<0.05；c为与顺铂组比较，P<0.05。

2.2　实时变光定量RT-PCR测定结果

不同浓度苦参碱、顺铂及苦参碱联合顺铂48 h后对TSLC1基因mRNA表达水平的影响见表2。结果表明，三组用药后，TSLC1基因表达水平均高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)；随着浓度的增加，影响效果增强，组间不同浓度两两比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；联合组高于顺铂组、苦参碱组，同浓度比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；顺铂组与苦参碱组同浓度比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3　实时突光定量RT-PCR特异性验证

实时突光定量RT-PCR特异性验证结果表明，SLC1基因溶解曲线为单峰，未出现引物的二聚体扩增和非特异性扩增。对引物同时进行实时突光定量RT-PCR检测，结果表明引物的特异性良好。

表2　不同浓度苦参碱、顺铂及苦参碱联合顺铂对TSLC1基因mRNA表达水平的影响±s)

注：a为与前一个浓度比较，P<0.05，b为与对照组比较，P<0.05。

3讨论

宫颈癌是女性恶性肿瘤之一，具有较高的死亡率。研究有效的控制措施对于提高预后具有重要意义。流行病学研究认为，宫颈癌的发病和患者性伴侣多、性行为早、吸烟等有直接的关系[5]。而且该病症的发病还和经济社会因素、地理环境因素等有关系。其中，以HR-HPV(高危型人乳头状瘤病毒)感染较严重[6]。该病毒在多数宫颈癌患者体内均存在，但感染该病毒并不是一定会发展为宫颈癌[7]。宫颈癌的发生时癌基因和抑癌基因共同作用的结果。一般情况下，人们根据其病症特点，将其分为三级预防，分别预防不同程度的病症感染[8]。

宫颈癌是对女性生活质量造成严重影响的病症之一，该病症具有较长的发展期，细胞学筛查是预防该病症的重要手段，其中，以巴氏染色、宫颈液基细胞学筛查为主要手段[9]。早期预防和治疗宫颈癌对降低患者死亡率、节约费用具有重要意义。

TSLC1(tumor suppressor in lung cancer-1，肺癌肿瘤因子)是1种新的肿瘤抑制因子，在人体组织中广泛表达，具有较高的细胞黏附功能，作为1种抑癌基因，能够和细胞之间相互黏附，发挥抑制效果[10]。TSLC1基因的表达和缺失，和宫颈癌、肺癌等由一定的相关性。病理学研究认为，患者在肿瘤发病晚期，TSLC1基因失活明显[11]。TSLC1基作为1种肿瘤抑制因子，在多种恶性肿瘤的发生发展中均有参与[12]。

恶性肿瘤的发展可分为三步，首先是癌细胞脱离癌组织，然后是癌细胞经血液、淋巴系统等移动，最后是癌细胞在远离原发灶的地方种植和生长[13]。TSLC1基因在宫颈癌组织中存在，参与了宫颈癌发生发展的全过程[14]。现阶段，中药治疗肿瘤是医学研究的新方向，部分中药能够抗肿瘤、增强机体免疫功能，较低的副作用，治疗效果较好[15]。苦参碱具有免疫调节等多种药理功能，其抗肿瘤效果正被不断研究[16]。

本文研究结果显示，顺铂、苦参碱联合顺铂均可显著抑制SiHa细胞体外增殖，差异具有统计学意义(P<0.05)；随着用药浓度的增加，抑制效果加大，组间不同浓度两两比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；联合组细胞抑制率高于苦参组、顺铂组，差异具有统计学意义(P<0.05)。三组用药后，TSLC1基因的表达均高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)；随着浓度的增加，影响效果加大，组间不同浓度两两比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；联合组高于顺铂组、苦参碱组，同浓度比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；顺铂组与苦参碱组同浓度比较，差异无统计学意义(P>0.05)。由此，苦参碱及联合顺铂对宫颈癌SiHa细胞中TSLC1基因表达有抑制作用，且对药物浓度呈剂量依赖性。

参考文献

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(编辑：吴小红)

(收稿日期2014-11-05修回日期 2015-01-29)

中图分类号：R730.53

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2015)03-0326-03

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.03.004

通讯作者：王纯雁