豚鼠耳蜗生物数值模型的实验研究

苏英锋，孙秀珍，刘迎曦，闫志勇，沈双，辛晓燕，于 申

(1.大连医科大学附属第二医院 耳鼻喉科，辽宁 大连116027;2.大连理工大学 工业装备结构分析国家重点实验室，辽宁 大连116024)

近年来，临床实践发现感音神经性耳聋患者发病率逐渐增高。耳蜗——执行感音功能的核心结构，负责将声音由机械能转换为电能，进一步经听神经传导入大脑，从而引起听觉。目前针对感音功能的研究手段主要包括:(1)功能测试如电测听、声导抗、耳声发射、脑干听觉诱发电位等;(2)形态学观察如扫描电镜和投射电镜观察等。然而上述研究措施已然难以适应现代耳科学研究的需要。鉴于耳传声与感音过程力学特征显著，运用生物力学方法对耳传声与感音功能进行研究逐渐得到了医、理学科研究人员的重视，此外，该方法还有助于定性、定位、定量描述器官结构与功能之间的关系［1］。因此，耳生物力学研究已经成为一个快速发展的新兴研究领域［2］。

关于耳蜗力学研究:早期的耳蜗数值模型假设耳蜗淋巴液为无粘滞性的理想流体，同时将Navier-Stokes 方程简化为线性方程，所建模型过于简化，与正常生理状态下的耳蜗有较大差别［3］;近年来，研究人员进一步建立了耳蜗三维数值模型，其所建模型将简化为直管状，其中的基底膜简化为直板形［4-6］;杨国标等［7］进一步基于micro -CT 建立了三维螺旋管形耳蜗模型，符合正常生理状态下耳蜗呈螺旋状结构的特性。

耳蜗位置深在、结构复杂，影像学扫描不能很好地显示其膜性结构，使得上述所建模型不能完全反映耳蜗膜迷路的结构特征，本实验拟通过连续组织切片技术获取耳蜗膜迷路结构的二维解剖数据，进一步建立豚鼠耳蜗宏观生物数值模型，并模拟耳蜗基底膜感音过程，以检验模型的准确性，为后续研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材 料

健康成年豚鼠1 只，体重500 g，雄性，由大连医科大学动物实验中心提供。耳廓反射灵敏，耳内镜检查未见异常，声导抗、耳声发射、脑干听觉诱发电位检查均无异常。

计算机软件:Photoshop 图像处理软件、Mimics和Hypermesh 软件、有限元分析软件ANSYS12. 0等。

1.2 方 法

1.2.1 制作豚鼠内耳连续组织切片:选择健康成年豚鼠1 只，运用10%水合氯醛2 mL 腹腔注射，麻醉后迅速断头，取出颞骨听泡并予以修剪，保留豚鼠耳蜗及前庭部分，用针尖在蜗尖骨壁钻孔，再挑开蜗窗下缘骨壁，用4%多聚甲醛进行蜗管内灌流，将内、外淋巴液充分灌流出去，同时固定膜迷路，然后迅速将组织块浸泡于4%多聚甲醛中固定48 h。然后，依次经过修剪、脱钙;清洗、脱水;透明、浸蜡;定位、包埋;塑型、切片;HE 染色，其中选择外定位法进行定位，最终制作一套完整的豚鼠内耳组织连续切片，切片厚度6 μm。

1.2.2 摄像并获取二维结构信息:采用带微距镜头单反数码相机(CANON EOS 7D MARK II)对豚鼠内耳组织切片进行摄像，相机设定为2020 万像素和最高图像精细度，采用jpg 格式保存彩色图像，将图像文件传送至计算机并进一步转换成bmp 格式图像，依次进行编号。

1.2. 3 耳蜗膜迷路和基底膜的三维重建:运用Adobe Photoshop 软件将上述图像转换成黑白色图片，然后进行识别、标记并强调边界，以增强对比度，利于识别内耳膜性结构。

本实验所获豚鼠内耳组织切片共480 张，为减少工作量，每3 张连续图片选择1 张进行数字化，进而三维重建，即所用图像间隔为12 μm。选择一张质量最好的切片作为定位基准，标记其4 个定位点的坐标，将其他图像定位点进行标记，以定位基准图片为标准利用自由变换工具进行旋转、移动等将所有三维重建图片定位点进行拟合。

将上述图片导入Mimics10.01 软件，识别内耳膜性结构和基底膜边界并形成边界点坐标。

运用Hypermesh 软件形成豚鼠内耳膜性结构和基底膜的边界的几何面。

将所获取的几何面导入到有限元软件ANSYS12.0，进一步生成豚鼠内耳膜性结构的三维几何模型，采用Solid45 单元进一步完整有限元剖分。

1.2.4 基于豚鼠耳蜗宏观生物数值模型的基底膜模态分析:为了确定所建模型基底膜振动特性，确定基底膜材料属性:杨氏弹性模量:E=2.0 ×105Pa，泊松比0. 3，密度为1200 kg/m3阻尼D = 10-6kg/m［8］;边界条件:基底膜的两侧面及蜗顶端施加固定位移约束，运用Block Lanczos 解法求解，得到模型前10 阶固有频率和振型，即模态分析。其中基底膜几何尺寸:蜗底直径为0.41 ×10-4m，蜗顶直径为2.75 ×10-4m，长度为1.40 ×10-2m，蜗底至蜗顶厚度逐渐增宽3 倍［11］。

2 结 果

2.1 建立豚鼠耳蜗宏观生物数值模型

通过组织连续石蜡切片及摄像，能够获得一整套豚鼠耳蜗连续切片的图像;所建豚鼠耳蜗的宏观三维生物数值模型能够清楚显示耳蜗的空间结构特性，耳蜗呈螺旋型，共4 周，其内基底膜亦呈螺旋状曲面上升，基底膜宽度不同，其中近蜗底部为0.41 ×10-4m，近蜗顶部为2. 75 ×10-4m，基底膜长度为1.40 ×10-2m。见图1。

图1 豚鼠耳蜗(A)基底膜(B)三维生物模型示意图Fig 1 3 - D Biological model of cochlea(A)and basilar membrane(B)

2.2 模态分析结果

声波信号传导入内耳后，基底膜振动具有频率特异性，其中低频声音激励下，最大行波振幅靠近基底膜耳蜗顶部，而在高频声音激励时，最大行波振幅则靠近基底膜底部，本实验分析频率阶次共10 阶，从1 阶依次到10 阶对应的最大行波振幅频率分别为2919.7 Hz、4409. 3 Hz、4946. 3 Hz、5650. 8 Hz、5910. 2 Hz、6575. 1 Hz、7134. 0 Hz、7359. 3 Hz、7858.6 Hz、8247.5 Hz。具体见图2。

3 讨 论

3.1 基于耳蜗二维结构数据建立三维模型的经验总结

图2 耳蜗基底膜模态分析基底膜振型云图(Ⅰ- Ⅹ阶)Fig 2 Cloud picture of modal shape of the basilar membrane(Ⅰ- Ⅹ)

制备能够满足生物力学模型构建所需要的二维组织切片的精度要求不同于常规实验要求，不仅要求结构保留完整，而且要求结构不能移位，否则所建模型便会失真。本实验过程中投入了大量的人力和物力保证二维结构数据的准确性。

本实验中耳蜗固定主要通过蜗尖注入4%多聚甲醛灌洗，其过程首先需要探针手工方法挑开蜗尖，会不同程度地损伤蜗尖相关结构，从而导致二维组织切片中靠近蜗顶的膜性组织移位、失真，使得在三维重建过程中需要耳科医生根据解剖学知识和经验予以修复。李寒等［9］提出心脏灌注能够满足耳蜗膜性结构固定的需要，而且可以避免结构的损伤，值得借鉴。

基于组织连续切片技术进行耳蜗三维重建的一个难点是定位，定位点的精度直接影响了三维重建结构的准确性和精确性。目前的定位方法主要包括:(1)利用钢针穿刺或激光打孔;(2)根据解剖学的相关知识进行辨别;(3)将标本的侧面修成平面［10］。本实验前期多次试制过程中发现外定位法相对稳定可行，遂采用植物杆茎作为定位物，包埋时不仅能够与石蜡紧密结合，而且不易移位，显微镜下观察发现大多数切片4 个定位点全部在位，少数切片有定位点脱落现象，但每张切片最少有2 个定位点，决定了后续三维重建过程的顺利进行。

石蜡组织切片具有制作方法简单、制备周期短、费用低廉、切片形态结构完整等特点［11］，能够满足宏观耳蜗生物模型的要求，但其切片厚度仅为4 ～6 μm，在展片的过程中易于发生组织的变形、扭曲及损坏，需要谨慎操作。尽管如此，仍然有部分切片不能达到要求，如切片染色不均、切片中混有杂质、部分结构缺失等，因此在配准以前仍然需要进一步处理，确保切片清晰，具体包括:(1)切片的过程中采用光镜进行观察，剔除结构有破坏的残片或废片;(2)切片完成后手工去除周边杂质或组织残端;(3)通过计算机软件将彩色图像转变为灰度图像，并调整比例大小［12-13］。

本实验最终所建模型清晰地显示了豚鼠耳蜗的空间结构特征，与Gan RZ 等［14-15］耳蜗重建结果一致。可见，基于组织连续切片技术建立耳蜗生物力学模型的方法可行，甚至可推广应用于其他小微器官生物数值模型的建立。

3.2 耳蜗基底膜生物数值模型的建立

本实验所建基底膜生物力学模型的结构特征为从蜗轴底部到蜗轴顶部呈螺旋状上升，基底膜呈上宽下窄，靠近底周最窄，靠近耳蜗顶部最宽，宽度分别为0.41 ×10-4m、2.75 ×10-4m，蜗底至蜗顶厚度逐渐增宽3 倍，与文献报道基本一致［15］。

模态分析可见振型特点:耳蜗基底膜的前10 阶固有频率介于2919.7 ～8247.5 Hz 之间，固有频率随阶次增加亦逐渐增加;第1 阶模态中，最大振幅发生于基底膜靠近蜗顶处，随阶次增加，最大振幅位置逐渐向基底膜蜗底部移动，与经典行波学结论基本吻合。杨国标等［7］基于数学方法分析结论一致，均与经典“行波学说”吻合，不同点在于其前10 阶固有频率在139.0 ～564.6 Hz，与本实验计算结果不一致。分析主要原因在于其将基底膜简化直板状，其“上底为0.05 mm，下底为5 mm，厚度为0.05 mm”，本实验模型的宽度为10-4m 数量级，相差近100倍;此外，两个模型均为简化基底膜模型，忽略了耳蜗Corti 器及淋巴液对基底膜的影响，亦是两者差别的原因所在;另外基底膜的梯度、坡度及倾斜角度等因素对基底膜的行波及位移具有重要影响。上述均提示本课题组仍然需要进一步建立更为精准的生物力学模型。

总之，本实验基于连续组织切片技术获得的耳蜗二维解剖数据建立三维有限元数值模型的技术路线可行，数值模拟结果与经典的行波学说基本吻合，为本课题组后续运用生物力学方法对耳蜗感音功能进行探索研究奠定了基础。

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