大鼠脊髓损伤程度与血清β-淀粉样前体蛋白及超敏C 反应蛋白的相关性研究

季英楠，阿 良，赵忠海，邓纯博

(沈阳医学院附属中心医院 骨外二科，辽宁 沈阳110000)

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是目前公认的疑难病之一，它具有高发生率、高致残率、高耗费率等特点，所以加强SCI 发病机制及损伤修复的研究具有十分重要的意义。脊髓损伤分为原发性损伤和继发性损伤两个阶段。继发性损伤是脊髓原发性损伤之后，由于各种因素引起的脊髓再损伤，所产生的脊髓损害远远超过了原发性损伤。SCI 继发性损伤病理过程中，β-淀粉样前体蛋白(β -APP)和超敏C 反应蛋白(hs-CRP)可作为一种快速反应性蛋白而诱导增高，聚集于局部损伤区域及周边。SCI后受到损伤、炎性反应等因素影响，血-脊髓屏障破坏，血管通透性增加，血液中β -APP、hs -CRP 在SCI 早期明显升高。本研究通过测定β - APP 及hs-CRP 血清动态变化，探究其与SCI 损伤程度的相关性，为进一步探讨β -APP、hs -CRP 水平在脊髓继发损伤机制中的作用提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

大鼠β - APP 定量检测ELISA 试剂盒、大鼠hs-CRP定量检测ELISA 试剂盒，酶标仪，动脉夹(35 g、95 g)，高速低温离心机，37 ℃恒温箱。

1.2 动物模型建立及功能评定

取雌性SD 大鼠90 只，体质量为260 ～280 g，随机分为3 组(每组30 只):重度损伤组、轻度损伤组和假手术组。麻醉满意后，动物取俯卧位。取脊柱正中纵形切口，暴露术野，确定T10椎板棘突后，切断T10～T11棘间韧带，并去除部分T11棘突，用有齿镊夹持T10棘突并稍向上提起，使T10～T11关节突关节分离，小心咬除T11上关节突外侧缘部分骨质，使T10下关节突下缘出现空隙，并以此为突破口向上咬除T10椎板，使T10脊髓充分暴露，轻度脊髓损伤组用35 g动脉夹夹持脊髓约30 s，重度脊髓损伤组用95 g 动脉夹夹持脊髓约30 s。可见大鼠脊髓后正中静脉变细，尾巴逐渐卷曲翘起，双后肢出现抽搐，随后双后肢及尾巴松弛瘫软，提示制模成功，缝合切口。假手术组仅行椎板咬除，术毕缝合切口。术后饮水不限、饲料定量给予(预防肠梗阻)，垫料保持干燥、每天挤压膀胱排尿3 次，直至排尿反射恢复。各组中大鼠如死亡，及时补充。分别在术后12 h、24 h、3 d 、7 d、14 d，根据后肢体位、活动方式、活动范围等对所有手术动物进行BBB 功能评分。

1.3 ELISA 血清制备及检测

检测不同程度SCI 大鼠伤后血清β - APP 和hs-CRP 含量变化。取SCI 后12 h、24 h、3 d、7 d 和14 d 的血清、96 孔的酶标包被板，固定于框架上，分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加人标准品50 μL，待测样本孔中先加入待测样本10 μL 及样本稀释液40 μL(样本稀释5 倍)。根据β-APP 和hs-CRP ELISA检测试剂盒说明书进行操作，在酶标仪上于450 nm波长处以阴性对照孔调0，检测各孔OD450值，根据标准品的浓度及对应的OD 值标准得出标准曲线，求出各组浓度值。

1.4 统计学方法

应用SPSS17.0 统计学软件，各组不同时间点血清β-APP 含量和hs - CRP 含量比较采用One -way ANOVA 方差分析，两两比较采用t 检验，P ＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 BBB 评分

重度损伤组分别与轻度损伤组、假手术组比较，各时间点差异均有显著性意义(P ＜0.05)。见表1。

表1 3 组动物不同时间点BBB 评分的比较Tab 1 The BBB scores at different time points in three groups (±s，n=9)

表1 3 组动物不同时间点BBB 评分的比较Tab 1 The BBB scores at different time points in three groups (±s，n=9)

1)与假手术组比较，P ＜0.05;2)与轻度损伤组比较，P ＜0.05

分组12 h 24 h 3 d 7 d 14 d重度损伤组 0.00 ±0.001)2) 0.00 ±0.001)2) 1.23 ±0.331)2) 2.23 ±0.561)2) 2.59 ±0.521)2)轻度损伤组 2.30 ±0.321) 3.12 ±0.391) 3.52 ±0.311) 4.06 ±0.481) 4.23 ±1.021)假手术组 20.00 ±0.02 21.00 ±0.00 21.00 ±0.00 21.00 ±0.0 0 21.00 ±0.00

2.2 血清β-APP 测定结果

SCI 后12 h 血清β -APP 含量明显升高，24 h达到高峰值，随后逐渐下降，14 d 时重度损伤组仍明显高于假手术组，轻度损伤组趋于正常水平。轻度损伤组除14 d 时与假手术组比较差异无显著性意义(P ＞0.05)外，其余各时间点与假手术组比较差异均有显著性意义(P ＜0.05)。重度损伤组分别与轻度损伤组、假手术组比较，各时间点差异均有显著性意义(P ＜0.05)。见表2、图1。

2.3 血清hs-CRP 测定结果

SCI 后12 h 血清hs-CRP 含量明显升高，3 d 达峰值，随后逐渐下降，14 d 时重度损伤组仍明显高于假手术组，轻度损伤组14 d 时趋于正常水平。轻度损伤组除14 d 时与假手术组比较差异无显著性意义(P ＞0.05)外，其余各时间点与假手术组比较差异均有显著性意义(P ＜0.05)。重度损伤组分别与轻度损伤组、假手术组比较，各时间点比较差异均有显著性意义(P ＜0.05)。见表3、图2。

表2 3 组动物不同时间点血清β-APP 含量的比较Tab 2 The serum level of β-APP at different time in three groups (ng/mL，±s)

表2 3 组动物不同时间点血清β-APP 含量的比较Tab 2 The serum level of β-APP at different time in three groups (ng/mL，±s)

1)与假手术组比较，P ＜0.05;2)与轻度损伤组比较，P ＜0.05

分组12 h 24 h 3 d 7 d 14 d重度损伤组 1200 ±101)2) 2310 ±151)2) 2112 ±261)2) 1680 ±91)2) 1189 ±151)2)轻度损伤组 1100 ±131) 2210 ±131) 1913 ±191) 1413 ±141) 1010 ±30假手术组1012 ±27 1011 ±19 1029 ±21 1022 ±18 1010 ±24

表3 3 组动物不同时间点血清hs-CRP 含量的比较Tab 3 The serum level of hs-CRP at different time in three groups (ng/mL，±s)

表3 3 组动物不同时间点血清hs-CRP 含量的比较Tab 3 The serum level of hs-CRP at different time in three groups (ng/mL，±s)

1)与假手术组比较，P ＜0.05;2)与轻度损伤组比较，P ＜0.05

分组12 h 24 h 3 d 7 d 14 d重度损伤组 32.51 ±0.691)2) 37.56 ±0.491)2) 79.23 ±0.531)2) 50.13 ±0.561)2) 34.56 ±0.521)2)轻度损伤组 30.25 ±0.321) 34.49 ±0.491) 67.61 ±0.511) 48.42 ±0.471) 30.41 ±1.01假手术组 29.34 ±1.38 29.30 ±1.48 28.60 ±1.49 28.89 ±1.4 7 30.01 ±1.23

图1 3 组动物不同时间点血清β-APP 含量变化Fig 1 The dynamic change of β-APP in serum at different time points

图2 3 组动物不同时间点血清hs-CRP 含量变化Fig 2 The dynamic change of hs-CRP in serum at different time points

3 讨 论

合理的SCI 动物模型是开展研究的前提，理想的动物模型制作方法应具有以下特点［1］:(1)与临床相近;(2)步骤客观化;(3)制作的模型一致性高;(4)压迫力度、时间可自行控制，可产生不同程度的损伤，压迫程度大小与脊髓程度损伤程度成线性关系;(5)操作简单;(6)经济实用。通过BBB 评分各组比较，重度损伤组分别与轻度损伤组、假手术组比较，各时间点比较差异均有显著性意义，说明动物模型建立成功，并与脊髓损伤临床表现相近，提示动脉夹钳夹脊髓损伤模型建立法更接近临床脊髓损伤机制，能更好的模拟继发性SCI 病理变化过程，具有良好的可行性及重复性，且经济实用。

β-APP 是一种相对分子质量为110 ～130 kD的大分子膜整合糖蛋白［2］，人体大多数细胞中可表达微量β -APP，它普遍存在于血液和脑脊液中，过去常用于对阿尔茨海默病及颅脑损伤的研究［3］。近年研究发现，血清β-淀粉样前体蛋白(β amyloid precursor protein，β -APP)和超敏C 反应蛋白(hypersensitive-cross-reactive protein，hs -CRP)作为急性期蛋白在脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)后继发性损伤阶段引起病情进一步恶化［4］。继发性脊髓损伤是在原发性损伤后一段时间内发生的包括水肿、炎性反应、生化反应、免疫反应、局部缺血、自由基损伤、细胞凋亡等一系列复杂的病理生理过程。SCI 后血脑屏障破坏，其通透性增加，β -APP 大量进入血液循环，β -APP 作为快速反应蛋白，在脊髓继发损伤过程中可诱导升高，关于β -APP 的表达增加更多学者认为其在SCI 过程中起保护作用。目前β-APP 已知的功能包括:(1)促进神经生长或具有神经营养活性;(2)诱导神经轴突的生长，与神经修复再生有关;(3)参与G 蛋白偶联的跨膜信号传导;(4)稳定钙离子通道，调节细胞粘附、抑制凝血等功能［5］。但其可异常水解产生大量Aβ，Aβ 被认为是导致神经毒性的始动因子，可引起细胞内钙离子失衡，促进氧自由基产生，启动脂质过氧化直接导致神经元损害［6］。β-APP 是轴浆运输功能障碍标志物，有研究表明缺血后2 h 即可见到轴索微管裂解，导致β-APP 溢出，造成β -APP 的聚积，故应用其检测受损伤轴索［7］。Graham 等［8］通过对致死型外伤性脑损伤者行免疫组织化学染色观察β -APP，发现神经元β -APP 染色阳性最早见于3 h。这也是此实验选用β -APP 作为SCI 后损伤程度敏感指标的基础。

CRP 是机体遭受创伤或感染后反应最为敏感的一种急性时相蛋白，它与炎性反应过程密切相关。当机体发生急性创伤后，IL -6 等炎性细胞因子可诱导肝脏内合成增加，血液CRP 水平明显增加，但CRP 特异性较差，使其应用受到限制。但有研究表明神经元、胶质细胞也可产生CRP［9］，这也增加了CRP 用于检测SCI 后损伤程度的特异性。而有研究表明SCI 后β-APP 的过量表达与CRP 建立联系，即β-APP 的异常表达产生大量Aβ，诱导IL -1、IL-6 炎性细胞因子释放，促进血清CRP 升高［10］，引起各种急性期反应，诱导细胞免疫和分子免疫反应，产生神经细胞毒性，加重脊髓继发性损伤，出现脊髓细胞坏死、轴突碎裂、脱髓鞘和空洞。通过本实验发现SCI 后12 h 血清β -APP 含量明显升高，24 h 达到高峰值，SCI 后12 h 血清hs -CRP 含量明显升高，3 d 达峰值，β-APP 比hs-CRP 更为敏感，轻度损伤组于14 d 可降至正常水平，重度损伤组血清水平仍高于正常，重度损伤组血清含量表达高于轻度损伤组，提示二者血清含量变化与损伤程度密切相关。

总之，通过动脉夹钳夹SD 大鼠脊髓，能够建立良好的、更接近临床脊髓损伤机制的模型。急性SCI 大鼠血清β - APP、hs - CRP 水平变化反映了SCI 的严重程度，β-APP 比hs-CRP 的变化敏感。

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