14，15-EET通过TRPV4-SKCa复合物调节气管平滑肌收缩机制研究

张 洁，沈 兵，桑大成，杜 鹃，丁圣刚

14，15-EET通过TRPV4-SKCa复合物调节气管平滑肌收缩机制研究

张 洁1，沈 兵1，桑大成1，杜 鹃1，丁圣刚2

摘要目的 探讨花生四烯酸细胞色素P450（CYP）表氧化酶代谢产物14，15-环氧化二十碳三烯酸（14，15-EET）对小鼠气管平滑肌收缩功能的影响及其机制。方法 采用离体气管实验，通过运用特异性钙激活钾通道阻断剂和瞬时受体电位离子通道4（TRPV4）通道阻断剂，观察14，15-EET对卡巴胆碱引起的小鼠气管收缩的影响；采用免疫共沉淀实验检测TRPV4通道蛋白与小电导钙激活钾通道（SKCa）蛋白在小鼠气管平滑肌组织中的相互作用。结果 与对照组相比，300 nmol／L 14，15-EET预处理小鼠气管后，卡巴胆碱引起的收缩显著减弱；大、中电导钙激活钾通道阻断剂IbTX和TRAM34没有显著影响14，15-EET对卡巴胆碱引起的小鼠气管收缩的抑制效应；而SKCa阻断剂Apamin和TRPV4通道阻断剂RN-1734都分别显著阻断了14，15-EET对卡巴胆碱引起的小鼠气管收缩的抑制作用。免疫共沉淀结果显示TRPV4通道蛋白和SKCa通道蛋白可以彼此相互共沉淀。结论 在小鼠气管平滑肌中，14，15-EET通过TPRV4-SKCa钙信号复合物调节气管平滑肌的收缩。

关键词钙激活钾通道；瞬时受体电位离子通道4；14，15-EET；气管平滑肌

2015-02-02接收

作者单位：1安徽医科大学基础医学院生理学教研室，合肥 230032

2安徽医科大学第一附属医院儿科，合肥 230022

支气管哮喘是由多种炎症因子参与的慢性气道炎症，因其患病率和死亡率的逐年上升，已成为严重威胁公众健康的一种主要慢性病。环氧化二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic acid，EETs）作为花生四烯酸的衍生物，可以使气管平滑肌舒张并减弱气管平滑肌细胞对Ca2＋的敏感性［1］，但其作用靶点还未完全阐明。该研究通过阐明EETs同分异构体中14，15-EET对激动剂引起的气管平滑肌收缩的作用及其机制，揭示气管平滑肌中瞬时受体电位离子通道4（transient receptor potential vanilloid 4，TRPV4）与小电导钙激活钾通道（small conductance Ca2＋-activated K＋-channel，SKCa）所形成的钙信号复合物在调节气管张力中的作用。

1　材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与仪器 14，15-EET购自英国Abcam Biochemicals公司；卡巴胆碱、RN-1734、TRAM34、Apamin等均购自美国Sigma公司；TRPV4、SKCa抗体购自美国Santa Cruz公司；二抗Goat-Anti-Rabbit IgG购自合肥志宏生物有限公司；Protein A Magnetic Beads购自美国Millipore公司；克氏液（NaCl 118 mmol／L、CaCl22.5 mmol／L、KCl 4.7 mmol／L、KH2PO41.2 mmol／L、MgSO4·7H2O 1.2 mmol／L、NaHCO325.2 mmol／L和glucose 11.1 mmol／L）；高钾溶液（NaCl 58 mmol／L、KCl 60 mmol／L、CaCl22.5 mmol／L、KH2PO41.2 mmol／L、MgSO4·7H2O 1.2 mmol／L、NaHCO325.2 mmol／L和glucose 11.1 mmol／L）。

1.1.2 实验动物 昆明种雄性小鼠，清洁级，6周龄，20～25 g，由安徽医科大学实验动物中心提供。正常进食饮水，室温维持（22±1）℃。

1.2 方法

1.2.1 气管环的制备 用CO2窒息法处死小鼠，迅速取出喉部以下的主支气管，放入备好的克氏（K-H）液并通有混合气体（95%O2和5%CO2）保持pH在7.40±0.05。在解剖显微镜下用精密手术剪和手术镊快速、轻柔地去除气管外周结缔组织，用粗糙的金属丝小心去除气管内皮，然后沿纵轴将气管剪成长约2 mm气管环。

1.2.2 离体气管张力实验 参照朱金行等［2］的实验方法，将分离干净的气管环悬挂于张力换能器上，并置于含有5 ml K-H液的浴槽内，通入含95%O2和5%CO2的混合气体；调节张力换能器，给予气管环500 mg前负荷，运用BL-420S生物机能实验系统检测气管张力信号，在K-H液中平衡40～60 min，且每隔15 min更换一次K-H液，待气管张力基线趋于稳定后，加入60 mmol／L的高钾溶液激动气管，收缩达峰值后，用K-H液洗3 min×4次，反复激动2

次后分两组，一组为对照组不做任何处理，另一组加入300 nmol／L 14，15-EET作为实验组；重复上述相同处理方法后分组，一组加入300 nmol／L 14，15-EET作为对照组，另一组加入IbTX阻断剂和300 nmol／L 14，15-EET预处理10 min（TRAM34、Apamin、RN-1734阻断剂方法同IbTX），然后加入不同浓度的卡巴胆碱，观察量效关系。

1.2.3 免疫共沉淀 从小鼠气管组织中提取蛋白进行免疫共沉淀实验。新鲜离体气管去掉脂肪、结缔组织，称重后加入适当体积的裂解液，冰上研磨裂解转入1.5 ml EP管中，置于冰上30～60 min，4℃、3 000 r／min离心5 min后取上清液。两个样品中分别加入抗TRPV4的抗体和抗SKCa抗体（抗SK3）进行免疫沉淀，4℃震荡2 h后分别加入预处理好的50 μl Protein A Magnetic Beads过夜；次日，于冰盒磁力架上吸附后弃上清液。清洗沉淀3次后加入50 μl 5×上样缓冲液煮沸，收集上清液后进行Western blot实验。

1.2.4 Western blot法 蛋白样品行SDS-PAGE电泳后以0.2 A恒流转膜，随后用5%脱脂牛奶封闭1 h，4℃孵育一抗过夜。次日，以PBST洗膜，5 min×3次，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，PBST漂洗5 min×3次，显色。

2　结果

2.1 14，15-EET对小鼠气管张力的影响 卡巴胆碱可以浓度依赖地引起小鼠气管环收缩（10-10～10-3mol／L），与对照组相比，300 nmol／L 14，15-EET预处理使卡巴胆碱引起的小鼠气管收缩显著减弱（P＜0.05），见图1。

2.2 3种Ca2＋激活钾通道阻断剂对14，15-EET引起的气管舒张的影响 大、中电导钙激活钾通道阻断剂50 μmol／L IbTX和10 μmol／L TRAM 34没有显著影响300 nmol／L 14，15-EET对卡巴胆碱引起的小鼠气管收缩的抑制效应；而SKCa阻断剂1 μmol／L Apamin显著阻断了14，15-EET对卡巴胆碱引起的小鼠气管收缩的抑制作用（P＜0.05），见图2。

2.3 TRPV4通道阻断剂对14，15-EET引起的气管舒张的影响 TRPV4通道阻断剂20 μmol／L RN-1734＋14，15-EET处理组与14，15-EET组相比，明显减弱了14，15-EET对卡巴胆碱引起的小鼠气管收缩的抑制效应（P＜0.05），见图3。

2.4 TRPV4蛋白和SKCa通道相互作用 将小鼠气管平滑肌组织裂解后，提取蛋白，上样分别为小鼠气管平滑肌裂解液、洗脱液、免疫共沉淀IP产物，实验结果显示，TRPV4蛋白和SKCa通道蛋白第三亚型SK3可以彼此相互共沉淀。见图4。

3　讨论

钙激活钾通道属于钾通道家族中的一个分支。根据其电导大小可分为大电导钙激活钾通道、中电导钙激活钾通道和SKCa通道。SKCa通道广泛存在于哺乳动物组织中，如平滑肌、骨骼肌、肾脏及内分泌细胞等［3］。TRPV4通道是瞬时受体电位离子通道家族（transient receptor potential，TRP）中香草素受体亚家族成员，属于非选择性阳离子通道，对Ca2＋具有一定的通透性，在生物体许多组织、器官中均有表达，可以感受低渗引起的细胞膨胀、机体温度变化以及佛波醇酯衍生物、细胞内外Ca2＋浓度、花生四烯酸等的理化刺激，参与调节体内渗透压、机械刺激、温度、血管张力以及气管平滑肌的收缩，维持机体内环境的稳定，对机体许多生理功能的正常完成有重要作用。

EETs有多种同分异构体，如5，6-EET、8，9-EET、11，12-EET和14，15-EET［4］。目前研究认为EETs有舒张血管、调节脏器局部血流和抗炎等多种功能［5-6］，还可作为第二信使在某些细胞信号转导过程中发挥重要作用［7］。有研究［8］显示，EETs能直接激活内皮细胞中的TRPV4通道调节血管平滑肌张力。然而，EETs引起平滑肌舒张的分子机制尚不十分清楚。在大鼠肠系膜动脉内皮细胞中，TRPV4 和SKCa可以形成钙信号复合物，通过TRPV4调节SKCa开放并引起血管平滑肌细胞超极化，从而引起血管舒张［9］。

气管平滑肌的收缩效应在调节呼吸系统疾病中起着重要作用。EETs作为花生四烯酸的衍生物，在哺乳动物的肺部、心脏和内皮细胞中都有表达［6，10-11］，在气管上皮细胞中被称为超极化因子起到舒张气管和抗炎的作用［6］。虽然EETs相关研究日益受到重视，但其对气管平滑肌功能的作用还未完全阐明。平滑肌的收缩是一个复杂的生理过程，有多种机制参与调节。有研究［9］报道在血管内皮细胞中，TRPV4-SKCa可形成钙信号复合物调节血管平滑肌的收缩。本研究中的免疫共沉淀实验结果显示，TRPV4和SKCa在气管平滑肌也可以形成钙信号复合物，而且气管张力实验表明，预先加入14，15-EET处理后比对照组对卡巴胆碱的收缩反应显著减弱，这是由于14，15-EET可以激活细胞膜上TRPV4通道，介导Ca2＋内流，导致局部Ca2＋浓度迅速升高，进而激活与其相互作用的SKCa通道产生外向钾电流并导致细胞膜超极化，反馈性抑制电压依赖钙通道，使Ca2＋内流减少、细胞内Ca2＋浓度降低，抑制气管平滑肌的收缩，最终引起气管舒张。因此，充分认识EETs对TRPV4-SKCa复合物在气管平滑肌细胞上

的作用机制对呼吸系统疾病的防治具有重要意义。

参考文献

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14，15-epoxyeicosatrienoic acid regulates airway smooth muscle contraction through TRPV4-SKCasignal complex

Zhang Jie，Shen Bing，Sang Dacheng，et al
（Dept of Physiology，College of Basic Medicine，Anhui Medical University，Hefei 230032）

AbstractObjective To provide a mechanistic insight into how 14，15-epoxyeicosatrienoic acid（14，15-EET）which is a product of cytochrome P450 epoxygenase regulates mouse airway smooth muscle contraction.Methods Isolated mouse tracheal tension was measured in vitro.Mouse tracheal rings were treated by Ca2＋-activated K＋channel blockers or transient receptor potential vanilloid 4（TRPV4）channel blocker.The changes of relaxation caused by 14，15-EET in tracheal rings were recorded after the tracheal rings were contracted by carbachol in concentration-dependent fashion.Co-immunoprecipitation was used to examine the physical interaction between TRPV4 and SKCain airway smooth muscle.Results Tracheal tension measurement showed that compared with the control group，carbachol-induced contraction in 300 nmol／L 14，15-EET pretreatment group was significantly reduced.BKCa and IKCa blockers did not affect the effect of 14，15-EET on carbachol-induced tracheal contraction.However，SKCaand TRPV4 blockers notably inhibited the effect of 14，15-EET on carbachol-induced tracheal contraction，respectively.Conclusion 14，15-EET regulates airway smooth muscle contraction via TRPV4-SKCasignal complex.

Key wordsCa2＋-activated K＋channel；transient receptor potential vanilloid 4；14，15-EET；airway smooth muscle

作者简介：张 洁，女，硕士研究生；沈 兵，男，副教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：shenbing＠anhui.edu.cn

基金项目：国家自然科学基金（编号：81371284）

文献标志码A

文章编号1000-1492（2015）05-0565-04

中图分类号Q 412