大鳞副泥鳅仔稚鱼生长与消化酶活性变化

刘亚秋 郭忠娣 胡 雨 高胜涛 王志坚

(西南大学生命科学学院, 淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室, 水产科学重庆市市级重点实验室,重庆 400715)

研究简报

大鳞副泥鳅仔稚鱼生长与消化酶活性变化

刘亚秋 郭忠娣 胡 雨 高胜涛 王志坚

(西南大学生命科学学院, 淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室, 水产科学重庆市市级重点实验室,重庆 400715)

大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)隶属于鲤形目,鳅科, 花鳅亚科, 副泥鳅属, 主要分布于长江中下游[1]。其肉质鲜美, 营养丰富。近年来, 大鳞副泥鳅的市场需求量逐年上升, 人工养殖规模不断扩大, 对大鳞副泥鳅鱼苗的需求量也逐渐增加。但是, 大鳞副泥鳅苗种阶段的高死亡率,成为了规模化人工商品鱼养殖生产的巨大阻碍。掌握大鳞副泥鳅仔稚鱼发育过程中摄食和消化的变化规律, 对于其苗种培育十分必要。消化酶活力是衡量仔稚鱼营养状况的重要的指标[2—4]。目前, 有关海水鱼类消化酶发育的研究较多[5—7], 而有关淡水鱼类的相关研究相对较少。大鳞副泥鳅仔稚鱼发育过程中消化酶活性变化的研究还没有报道。本研究探究了仔稚鱼的生长过程和主要消化酶活性变化过程, 为大鳞副泥鳅苗种培育技术开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验鱼

大鳞副泥鳅初孵仔鱼由重庆市垫江水产站提供, 所获仔鱼均由同一批受精卵于4月20日孵化出膜, 饲养50d, 于6月10日结束, 鱼苗饲养于容积100 L的3个循环水族缸内, 每个水族缸内饲养2000尾。5 DAH (日龄, Day after hatching)仔鱼开始投喂丰年虫(天津市丹阳水产科技有限公司), 10 DAH之后投喂混合饵食(丰年虫, 微颗粒S1饲料)20 DAH后全部投喂微颗粒S1饲料(山东升索渔业饲料研究中心), 投喂之前清除污物。饲养期间每天饱食投喂4次, 投喂时间为7:00、12:00、17:00和22:00。

1.2 饲养条件

饲养期间, 每天 8:00、14:00和 20:00测量水温取平均值, 循环水族缸水温变化范围为 20.5—25.5℃, 循环水族缸保持24h充氧, 溶氧保持在(7.21±0.63) mg/L。

1.3 样品采集

全长与体重测量时间安排为1、2、3、4、5、7、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45和50 DAH(孵化当日记为 0 DAH), 并选取 1、2、3、4、5、7、9、12、15、20、25、30和45 DAH样品用于测量消化酶活性测定。为了准确测量鱼体内消化酶活性, 实验在中午 12:00投喂完以后2h取样, 从3个水族缸中随机捞取鱼苗分别放入装有清水的不同烧杯中, 1h后捞出, 各取10尾测量全长, 称总体重。称量过程中样本置于冰上, 以免消化酶失活。20 DAH之前样品取全鱼, 20 DAH开始的样品去除头部和尾部, 仅保留躯干。样品立即置于–80℃超低温冰箱保存, 用于进一步消化酶测定。

1.4 特定生长率的测定

根据样品总质量计算个体的平均质量。特定生长率的计算公式: SGR=100×(lnFBW–lnIBW)/T, 其中FBW为个体终末体量(g), IBW为个体初始体重(g), T为时间(d)。

1.5 可溶性蛋白含量和消化酶活性的测定

从冰箱中取出待测样品, 置于冰上解冻。解冻完成后将样品称重, 按质量 ∶体积为 1∶4加入匀浆稀释液, 以匀浆器进行匀浆。所得匀浆液用低温超速离心机 4℃, 3000 r/min转速离心20min后取上清液用于消化酶活力测定。实验中的消化酶及可溶性蛋白均使用南京建成公司生产的试剂盒检测。在pH 8.0, 37℃条件下, 每毫克蛋白质中含有的胰蛋白酶每分钟使吸光度变化0.003定义为1个胰蛋白酶活力单位。在 37℃条件下, 每克组织蛋白在反应体系中与底物反应1min, 每消耗1 µmol底物定义为1个脂肪酶活力单位。组织中每毫克蛋白在 37℃与底物作用30min, 水解10 mg淀粉定义为1个淀粉酶活力单位。每克组织蛋白在37℃与基质作用15min产生1 mg酚定义为1个碱性磷酸酶活力单位。实验中测定酶的全活力表示为1个个体所含有的酶活力单位的量(U/larva); 酶的比活力表示为 1 mg可溶性蛋白所含有的酶活力单位的量(U/mg protein)。本实验使用全波长酶标仪(Thermo)和紫外分光光度计(UV-2450)测定吸光度。

1.6 数据分析

采用单因子方差分析(ANOVA)检验不同测定日期间可溶性蛋白含量和各消化酶活性差异显著性。如差异显著,则采用多重比较方法比较平均数之间的差异。显著性水平为0.05。数据分析采用SPSS 17.0统计软件进行。实验数据均用平均值±标准差(means± SD)表示。

2 结果

2.1 生长以及投喂状况

大鳞副泥鳅仔稚鱼经过 50d饲喂后, 其生长情况如图1所示。体重由0.70 mg增至998 mg。特定生长率为14.52%, 全长由3.25 mm增至55.24 mm。在发育过程中,全长和体重分别呈线性和指数形式增长, 拟合方程分别为: y=1.1129x(R2=0.9914)和y= 0.0014e0.1536x(R2=0.9244)。

2.2 可溶性蛋白含量

大鳞副泥鳅仔稚鱼的可溶性蛋白含量的变化情况如图2所示, 在1—3 DAH, 可溶性蛋白含量下降, 并3 DAH时到达最小值(0.16±0.01) mg/mL。5 DAH后, 可溶性蛋白质含量快速上升, 15 DAH后显著下降, 20 DAH后蛋白质含量逐渐增加, 45 DAH时达到(1.58±0.05) mg/mL。

2.3 消化酶的全活力

大鳞副泥鳅仔稚鱼消化酶全活力的变化如图3所示。初孵仔鱼均可检测到淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶以及碱性磷酸酶活性。仔鱼淀粉酶全活力在1—15 DAH缓慢上升, 在15 DAH后快速上升, 30 DAH后趋于稳定。脂肪酶全活力在1—9 DAH变化不显著(P＞0.05), 9—15 DAH缓慢上升, 15 DAH 后显著上升(P＜0.05), 45 DAH 达到(0.40±0.05) U/larva。胰蛋白酶全活力在1—5 DAH无显著变化(P＞0.05), 5 DAH后缓慢上升, 15 DAH后显著升高(P＜0.05), 30 DAH增长速度变慢, 渐趋于稳定。碱性磷酸酶全活力从1 DAH至15 DAH逐渐增加, 到20 DAH显著上升(P＜0.05)。到30 DAH以后上升速度逐渐变慢。

2.4 消化酶比活力

图1 大鳞副泥鳅仔稚鱼个体全长和体重随日龄变化Fig. 1 Total length and body weight of Paramisgurnus dabryanuslarvae and juveniles during the experiment

图2 大鳞副泥鳅仔稚鱼可溶性蛋白含量随日龄变化曲线Fig. 2 Fluctuation of souble protein content of Paramisgurnus dabryanus larvae and juveniles during the experiment

图3 大鳞副泥鳅仔稚鱼发育过程中消化酶全活力变化曲线Fig. 3 Fluctuations of total activities of digestive enzymes for Paramisgurnus dabryanus larvae and juveniles during the experiment

大鳞副泥鳅仔稚鱼发育过程中消化酶比活力变化曲线如图4所示。淀粉酶比活力1—5 DAH间快速上升, 5 DAH达到峰值(2.65±0.09) U/mg protein。随后淀粉酶比活力显著下降(P＜0.05), 到 15 DAH, 淀粉酶比活力下降至(0.87±0.04) U/mg protein。20 DAH淀粉酶比活力小幅上升(1.33±0.02) U/mg protein, 随后又缓慢下降, 30 DAH后趋于稳定。脂肪酶比活力在5 DAH和20 DAH有两个明显的峰值分别为(0.32±0.02)和(0.84±0.13) U/mg protein,分别是仔鱼卵黄囊耗尽, 由混合营养期向外源性营养期转变以及仔鱼向稚鱼转变关键点。5—15 DAH比活力呈现一定的波动, 并在 9 DAH出现一个最小值(0.13±0.02) U/mg protein。20 DAH之后比活力显著下降(P＜0.05), 到25 DAH趋于稳定。胰蛋白酶比活力1—7 DAH间快速升高, 7 DAH达到最大值(78.97±8.09) U/mg protein, 随后显著下降(P＜0.05), 到15 DAH降至最低点(10.12±0.90) U/mg protein; 25 DAH后, 比活力逐渐趋于平稳。碱性磷酸酶比活力从2 DAH开始显著上升(P＜0.05), 在5 DAH达到最大值(0.78±0.05) U/mg protein, 之后迅速降低, 15 DAH降至最低值(0.22±0.06) U/mg protein, 20 DAH到另一个峰值(0.36±0.04) U/mg protein, 到25 DAH, 比活力趋于稳定状态。

3 讨论

在本实验(21.5±1.50)℃条件下, 大鳞副泥鳅仔稚鱼的生长较梁秩 燊等[8]报道要慢, 可能是因为本实验中养殖水温较低的原因所致(后者实验温度为25℃以上)。仔鱼发育到出膜后5 DAH开始投喂丰年虫, 并能在体视显微镜下检测到消化管中丰年虫的存在。可溶性蛋白含量在3 DAH降至最低, 5 DAH后开始上升。1—3 DAH, 仔鱼尚未开口, 主要由卵黄囊里的营养物质为其生长发育提供能量, 随着卵黄蛋白不断消耗, 总蛋白含量呈下降趋势。5 DAH开始投喂, 仔鱼蛋白含量开始明显上升。因此, 可溶性蛋白含量变化过程与仔稚鱼鱼营养方式转换过程相关。

本研究大鳞副泥鳅1 DAH仔鱼中检测出淀粉酶, 胰蛋白酶, 脂肪酶, 碱性磷酸酶的活性。其他一些淡水和海水鱼类, 例如塞内加尔鳎( Solea senegalensis)[9]、细点牙鲆 (Dentex dentex)[7]、 斑 带 副 鲈 (Paralabrax maculatofasciatus)[10]、黄尾(Seriola lalandi)[11]、胭脂鱼(Myxocyprinus asiaticus)[12]、瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)[13]等, 在开口前也可以检测到消化酶的活性。这表明消化酶的发生并不是外源食物的诱导, 可能是受到鱼类自身基因的调控[7, 10, 14, 15]。

大鳞副泥鳅仔鱼消化酶全活力和比活力表现出完全不同的变化模式, 全活力的上升趋势, 而比活力呈先上升后下降的变化趋势, 这与仔鱼体内可溶性蛋白的累积有关[9]。在实验中, 5 DAH初次投喂后, 胰蛋白酶活力显著上升, 并在7 DAH达到最大值。这说明外源食物对于胰蛋白酶分泌起到了一定刺激作用[16]。7—15 DAH胰蛋白酶活力显著下降, 这一方面是由于大鳞副泥鳅体内的可溶性蛋白的累积[5], 另一方面是由于消化器官尚未发育完全。在仔鱼开始摄食后, 消化酶活性主要受到消化器官发育的影响。在20 DAH达到峰值后逐渐下降, 25 DAH后趋于稳定。20 DAH是大鳞副泥鳅仔鱼向稚鱼转变的关键点。胰蛋白酶的全活力在此期间快速增加。证明了在这一时期仔鱼消化体系更加完善。

图4 大鳞副泥鳅仔稚鱼发育过程中消化酶比活力变化曲线Fig. 4 Fluctuations of specific activities of digestive enzymes for Paramisgurnus dabryanus larvae and juveniles during the experiment

有学者研究表明早期仔鱼体内存在脂酶和磷脂酶 A2两种不同类型的脂肪酶。磷脂酶 A2可被磷脂激活, 而仔鱼的卵黄囊富含磷脂, 脂酶能被三酸甘油酯激活, 它的活性与外源食物中脂肪消化密切相关[17, 18]。初次摄食后脂肪酶比活力显著下降是这两种脂肪酶相互转变引起的[5, 10]。5—15 DAH脂肪酶比活力呈现一定的波动变化后开始显著上升, 这是由于胰腺外分泌功能以及利用食物中脂肪能力增强所致[2]。20 DAH之后显著下降后趋于稳定。这可能是鱼体自身对于食物摄入量的变化和可溶性蛋白沉积所致[19]。

仔鱼在开口摄食之前, 淀粉酶已具有较高的比活力。这与卵黄囊中含有较丰富的糖原有关。大鳞副泥鳅淀粉酶比活力的两个峰值分别出现在内源向外源性营养转变期和仔鱼向稚鱼的转变期[8]。淀粉酶比活力在5 DAH后显著下降, 是由于仔鱼肠道上皮细胞增加, 仔鱼对蛋白质和脂肪的利用能力增强, 而对糖类的利用能力减弱。20 DAH后停止投喂丰年虫, 全部投喂糖类含量相对较低的饲料可能是导致淀粉酶比活力的下降的原因[20]。也有学者认为在仔鱼消化系统的发育过程中会出现淀粉酶分泌功能减弱的现象[21, 22]。

碱性磷酸酶是一类单酯磷酸水解酶, 主要存在于鱼类前肠上皮细胞的浅部和纹状缘上, 体外的碱性磷酸酶在碱性条件下起催化无机和有机磷酸酯水解的作用[5]。并有多数学者提出, 将碱性磷酸酶活性显著上升作为仔鱼肠道功能发育完全的标志[2, 5, 21]。大鳞副泥鳅初孵仔鱼就检测到活性, 这种现象在其他多种鱼类中也有报道[9, 10]。仔鱼在2—5 DAH显著上升, 表明了大鳞副泥鳅仔鱼肠道消化功能在这个阶段的快速发育。15—20 DAH 碱性磷酸酶比活力显著性上升, 提示这个期间肠细胞逐渐成熟,肠道消化功能逐渐完善。

4 结论

大鳞副泥鳅仔稚鱼在发育过程中, 消化酶的活性随仔鱼消化系统的发育变化显著。大鳞副泥鳅为杂食性鱼类,在早期对糖类物质消化能力较强, 随着消化系统发育完善, 对于蛋白质, 脂肪利用率提高, 而减弱了对糖类物质的利用。在培育苗种过程中, 可根据不同发育时期消化酶活性的变化来相应调整饵料配方, 从而促进仔稚鱼的生长和提高育苗成活率。

[1] Ding R H. The Fishes of Sichuan, China [M]. Sichuan: Sichuan Science and Technology Press. 1994, 120-122 [丁瑞华. 四川鱼类志. 四川: 四川科学技术出版社. 1994, 120—122]

[2] Comabella Y, Mendoza R, Aguilera C, et al. Digestive enzyme activity during early larval development of the Cuban gar (Atractosteus tristoechus) [J]. Fish Physiology Biochemistry, 2006, 32(2): 147—157

[3] Ueberschä r B. Measurement of Proteolytic Enzyme Activity: Significance and Application in Larval Fish Research [M]. Physiological and Biochemical Aspects of Fish Development. University of Bergen, Norway. 1993, 233—237

[4] Ji H, Sun H T, Tian J J, et al. Digestive enzyme activity during early larval development of the paddlefish Polyoodon spathula [J]. Acta Hydrobiologica Sinca, 2012, 36(3): 458—463. [吉红,孙海涛, 田晶晶, 等. 匙吻鲟仔稚鱼消化酶发育的研究. 水生生物学报, 2012, 36(3): 458—463]

[5] Alvarez-González C A, Cervantes-Trujano M, Tovar-Ramírez D, et al. Development of digestive enzymes in California halibut Paralichthys californicus larvae [J]. Fish Physiology Biochemistry, 2005, 31(1): 83—93

[6] Reza A, Gholamreza R, Soheil E, et al. Ontogeny of the digestive enzyme activities in hatchery produced Beluga (Huso huso) [J]. Aquaculture, 2013, 416: 33—40

[7] Gisbert E, Giménez G, Fernández I, et al. Development of digestive enzymes in common dentex Dentex dentex during early ontogeny [J]. Aquaculture, 2009, 287(3—4): 381—387

[8] Liang Z X, Liang J Y, Chen C, et al. The embryonic development and fingerling culture of loach, Paramisgurnus dabryanus sauvage [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 1988, 12(1): 28—39 [ 燊梁秩 , 梁坚勇, 陈朝, 等. 大鳞副泥鳅的胚胎发育以及鱼种培育. 水生生物学报, 1988, 12(1): 28—39]

[9] Martínez I, Moyano F J, Fernández-Díaz C, et al. Digestive enzyme activity during larval development of the Senegal sole (Solea senegalensis) [J]. Fish Physiology Biochemistry, 1999, 21(4): 317—323

[10] Alvarez-González C A, Moyano-López F J, Civera-Cerecedo R, et al. Development of digestive enzyme activity in larvae of spotted sand bass Paralabrax maculatofasciatus. Biochemical analysis [J]. Fish Physiology Biochemistry, 2008, 34(4): 373—384

[11] Ben N C, Jian G Q, Martin S K, Ontogenetic development of digestive enzymes in yellowtail kingfish Seriola lalandi larvae [J]. Aquaculture, 2006, 260: 489—501

[12] Zheng K D, Chen G L, Sun B, et al, Variations of growth and digestive enzymes activities in the developmental Chinese sucker larvae (Myxocyprinus asiaticus Bleeker) [J]. Freshwater Fisheries, 2010, 40(6): 9—14 [郑凯迪, 陈桂来, 孙彬,等．胭脂鱼仔鱼的生长和消化酶活力变化．淡水渔业, 2010, 40(6): 9—14]

[13] Li Q, Long Y, Qu B, et al. Assessment of digestive enzymes activities during larval development of Pelteobagrus vachelli [J]. Journal of Fishes Sciences of China, 2008, 15(1): 73—78 [李芹, 龙勇, 屈波, 等. 瓦氏黄颡鱼仔稚鱼发育过程中消化酶活性变化研究. 中国水产科学, 2008, 15(1): 73—78]

[14] Lazo J P, Mendoza R, Holt G J, et al．Characterization of digestive enzymes during larval development of red drum (Sciaenops ocellatus) [J]. Aquaculture, 2007, 265: 194—205

[15] abaei S S, Abedian Kenari A, Nazari R, et al. Developmental changes of digestive enzymes in Persiansturgeon (Acipenser persicus) during larval ontogeny [J]. Aquaculture, 2011, 318(1—2): 138—144

[16] Chen B N, Qin J G, Carragher J F, et al. Deleterious effects of food restrictions in yellowtail kingfish Seriola lalandi during early development [J]. Aquaculture, 2007, 271(1—4): 326—335

[17] Oozeki Y, Bailey K M．Ontogenetic development of digestive enzyme in activities in larval walleye pollock Theragra chalcogramma [J]．Marine Biology, 1995, 122(2): 177—186

[18] Izquierdo M S, Socorro J, Arantzamendi L, et al．Recent advances in lipid nutrition in fish Larvae [J]. Fish Physiology Biochemistry, 2000, 22(2): 97—107

[19] Morals S, Cahu C, Dinis M T, et al. Dietary TAG source level affect performance and lipase expression in larval sea bass (Dicentrarchus labrax) [J]. Lipids, 2004, 39(5): 449—458

[20] Ma H, Cahu C, Zambonino-Infante J L, et al. Activities of selected digestive enzymes during larval development of large yellow croaker (Pseudosciaena crocea) [J]. Aquaculture, 2005, 245(1—4): 239—248

[21] Rbeiro L, Zambonino-Infante J L, Cahu C, et al. Development of digestive enzymes in larvae of Sole asenegalensis, Kaup1858 [J]. Aquaculture, 1999, 179(1): 465—473

[22] Zmbonino-Infante J L, Cahu C L．Development and response to a diet change of some digestive enzymes in sea bass (Dicentrar-chus labrax) larvae [J]. Fish Physiology Biochemistry, 1994, 12(5): 399—408

GROWTH AND FLUCTUATIONS OF DIGESTIVE ENZYMES ACTIVITIES IN PARAMISGURNUS DABRYANUS DURING LARVAL AND JUVENILE STAGES

LIU Ya-Qiu, GUO Zhong-Di, HU Yu, GAO Sheng-Tao and WANG Zhi-Jian
(Key Laboratory of Freshwater Fish Reproduction and Development, Ministry of Education, the Key Laboratory of Aquatic Science of Chongqing, School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

大鳞副泥鳅; 仔稚鱼; 生长; 消化酶活力

Paramisgurnus dabryanus; Larvae and juveniles; Growth; Digestive enzymes activities

Q175

A

1000-3207(2015)06-1236-05

10.7541/2015.161

2014-10-30;

2015-05-17

公益性行业(农业)科研专项(201203086); 重庆市科委重点实验室专项经费资助

刘亚秋(1990—), 男, 湖北武汉人; 硕士研究生; 主要研究方向为水生生物学。E-mail: 393386160@qq.com

王志坚(1969—)男, 教授; E-mail: wangzj1969@126.com