不同有机碳源对灵芝液体发酵灵芝酸生产的影响

鲍 锐，吴世良，王松华

(安徽科技学院 生命科学学院，安徽 凤阳 233100)

不同有机碳源对灵芝液体发酵灵芝酸生产的影响

鲍 锐，吴世良，王松华*

(安徽科技学院 生命科学学院，安徽 凤阳 233100)

目的：研究不同有机碳源对灵芝液体发酵灵芝酸生产的影响。方法：研究不同浓度的玉米粉、小麦粉、荞麦粉下灵芝液体发酵菌丝体干重、灵芝酸含量及产量。结果：培养基玉米粉浓度4g/L时，菌丝体干重和灵芝酸产量分别达到最大值，较对照组提高了1.11和1.26倍；培养基小麦粉浓度10g/L时，干重和产量分别比对照组提高了0.73和0.87倍；培养基荞麦粉浓度7g/L时，干重和产量分别比对照组提高了0.97和1.15倍。培养基玉米粉浓度7g/L时，灵芝酸含量达到最大值23.538mg/g。培养基中玉米粉浓度为4、5、7、10g/L时，灵芝酸产量差异不显著。结论：从生产实际考虑，应使用4g/L的玉米粉优化培养基。

有机碳源；液体发酵；灵芝酸；菌丝体干重；含量；产量

随着社会生产的发展，人们对灵芝的深入研究，灵芝的药用价值得到极速的提升，尤其灵芝中的灵芝酸与多糖，对人体具有极大的益处[1-2]。灵芝多糖具有降血糖[2]、抗肿瘤[3]、调节免疫[4]等方面具有重要作用，而灵芝酸具有保肝抗病毒的功能作用[5-7]。有机物是生命物质产生的基础，对生物的正常生长和代谢具有重要的作用，玉米、小麦、荞麦作为复合有机物碳源，研究表明：复合有机碳源比一般单糖(葡萄糖)，二糖(麦芽糖、蔗糖)更有益于液体发酵中菌丝体的生长[8-9]。本试验研究玉米粉、小麦粉、荞麦粉对灵芝液体发酵中菌丝体生物量、灵芝酸含量与产量的影响，筛选出灵芝发酵最佳碳源。

1 材料与方法

1.1 菌种

由上海农科院食用所提供，由本实验室长期保存。

1.2 培养基配制与培养方法

1.2.1 培养基配制 PDA培养基制备(500mL)：马铃薯100g加蒸馏水煮开至10～15min，除去马铃薯残渣，加蔗糖10g、琼脂 7.5g溶解；

种子液培养基制备(500mL)：马铃薯100g、蔗糖10g、酵母膏1.25g、七水硫酸镁1.5g、磷酸二氢钾2.4g、鱼粉蛋白胨1.25g；

扩大培养基制备(1000mL)：磷酸二氢钾1g、硫酸镁1g、葡萄糖20g、鱼粉蛋白胨10g。

1.2.2 培养方法 灵芝斜面菌种活化：从母种斜面切除小拇指块状的菌种接与斜面中部，放在恒温恒湿箱28℃下培养7d，放到4℃冰箱保存；

种子液培养：取斜面菌种一支，将其菌种接种到250mL三角瓶(装液量100mL),于恒温摇床28℃、转速150r/min培养7d，于冰箱4℃保存；

扩大培养：用高速分散器将种子液打碎，移液枪取5mL到250mL三角瓶(装液量100mL),恒温摇床培养7d。

1.3 试剂配制

5%冰乙酸-香草醛：准确称取香草醛5g,冰乙酸溶解并定容到100mL,即为5%冰乙酸-香草醛；

熊果酸标准曲线:准确称取烘干至恒重的熊果酸标准品8.0mg，无水乙醇溶解并定容100mL，即为0.08mg/mL熊果酸标准溶液。

1.4 试验设计方案

采用单因素分别研究了不同浓度的玉米粉、小麦粉、荞麦粉对灵芝液体发酵的影响。

1.5 分析及测定方法

1.5.1 熊果酸标准曲线制作 取试管7支，依次加入熊果酸标准液0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mL，并加5%冰乙酸-香草醛0.5mL和高氯酸0.8mL，密封水浴60℃,15min后取出，冰水混合冷却3min,依次加入冰乙酸5、2.95、2.90、2.85、2.80、2.75、2.70mL， 548nm下测其吸光度，并绘制标准曲线。标准曲线方程：y=0.0117x-0.0018,R2= 0.9992。

1.5.2 菌丝体生物量测定 用纱布过滤沉淀物，并洗涤沉淀物3～5次，于60℃烘箱中烘干，并称其干重。

1.5.3 灵芝酸的提取与测定 研磨菌丝体并称取0.10g，加入无水乙醇10mL,放入到超声波震荡器震荡3h，取上清液5.0mL，6000r/min，离心10min。取样品液0.20mL加入5%冰乙酸-香草醛0.50mL、高氯酸0.80mL密封，60℃水浴15min。再加入冰乙酸2.80mL，摇匀测吸光度，通过熊果酸标准曲线算出胞内酸含量。

2 结果与分析

2.1 玉米粉对灵芝液体发酵的影响

将不同浓度的玉米粉分别加入到扩大培养基中，培养7d收获。结果表明，玉米粉对灵芝菌丝体生物量(图1)和灵芝酸产量(图3)影响较显著。对于灵芝酸含量，玉米粉浓度在7g/L时，与对照组相比，差异显著(图2)。当玉米粉浓度达到4g/L时，其菌丝体生物量与灵芝酸产量分别达到12.434g/L和238.654mg/L，分别是对照组的2.11、2.26倍。

2.2 小麦粉对灵芝液体发酵的影响

小麦粉按照不同浓度添加到扩大培养基中，培养7d收获。结果表明，小麦粉对灵芝菌丝体生物量(图4)和灵芝酸产量(图6)影响较显著，而对于灵芝酸含量基本没有影响(图5)。在小麦粉7个组别中，小麦粉浓度为1、3、4、5、7g/L组间菌丝体生物量与灵芝酸产量差异不显著，浓度为10g/L时，菌丝体生物量与灵芝酸产量达到最大值，分别为对照组1.73、1.87倍。

2.3 荞麦粉对灵芝液体发酵的影响

将不同浓度的荞麦粉依次加入到扩大培养基中，培养7d收获。结果表明，与对照组相比，荞麦粉对灵芝菌丝体生物量(图7)和灵芝酸产量(图9)影响较显著，而对于灵芝酸含量基本没有影响(图8)。当培养基中加入4g/L荞麦粉时，其菌丝体生物量与浓度为1、3g/L比较，差异显著，与5、7、10相比，差异不显著。

2.4 玉米粉、小麦粉、荞麦粉对灵芝液体深层发酵的比较

相同情况下相比较，加入玉米粉4g/L比小麦粉、荞麦粉的菌丝体生物量增加显著，且达到最大值12.434g/L；小麦粉、荞麦粉菌丝体生物量呈上升趋势，并且浓度在1、3、4、5、7g/L荞麦粉菌丝体生物量显著高于小麦粉(图10)。

培养基中加入玉米粉为7g/L的实验组，灵芝酸含量要显著高于添加相同浓度的小麦粉与荞麦粉试验组，且达到最大值23.538mg/g(图11)。培养基中玉米粉浓度为4、5g/L试验组灵芝酸产量均显著高于同浓度小麦粉、荞麦粉试验组(图12)。培养基中玉米粉浓度为4、5、7、8g/L试验组灵芝酸产量差异不显著。相同浓度下，灵芝酸产量荞麦粉试验组要高于小麦粉试验组。

3 结论与讨论

碳源作为灵芝生长代谢的主要物质之一，为菌丝体提供碳源骨架和生命活动所需要的能量，灵芝菌丝体生长对于不同的碳源的利用效率是不同的[10]。而玉米粉、小麦粉、荞麦粉作为一种复合有机碳源，都含有大量的蛋白质和淀粉。玉米粉含有脂肪、维生素B2、磷元素、亚油酸、维生素E和较多的钙、铁、硒元素；小麦粉中富含脂肪、维生素、碳水化合物、矿物质(钙、铁、磷、钾等)；荞麦粉富含维生素E、元素(铁、镁、锌等)以及某些黄酮。不仅为菌丝体的生长提供所需碳源外，而且也能够提供其他营养物质，研究表明钙离子在细胞内信号转导起着重要的作用[11-12]；

本研究表明，使用玉米粉、小麦粉、荞麦粉优化培养基，可以提高灵芝菌丝体的生长，但对于灵芝酸的含量影响并不明显。研究结果表明培养基中加入玉米粉4g/L可以显著提高菌丝体生物量111%，达到12.434g/L,灵芝酸产量238.654mg/L；培养基中加入小麦粉10g/L可以提高菌丝体干重73%,达到10.196g/L，灵芝酸产量199.698 mg/L；培养基中加入荞麦粉7g/L可以提高菌丝体干重97%，达到11.637g/L，灵芝酸产量227.125mg/L。

此外，可以得出玉米粉、小麦粉、荞麦粉对于灵芝液体发酵影响存在差异性，玉米粉对于提高灵芝酸的产量更有效。有研究[9]表明复合碳源比一般单一碳源产量高的原因可能是复合碳源含有葡萄糖、蛋白质、多种矿物质以及微量元素，更有利于菌丝体的生长。目前，有关复合碳源在灵芝液体发酵中应用报道较少，尤其是相关作用机制有待进一步研究。在今后规模化灵芝液体发酵生产灵芝酸中，选择玉米粉作为发酵过程中的主要碳源，可以更有效的提高灵芝酸的产量。

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(责任编辑：李孟良)

Effects of Different Organic Carbon Sources on the Production of Ganodermic Acid form Liquid Fermentation of Ganoderma Lucidum

BAO Rui,WU Shi-liang, WANG Song-hua*

(College of Life Science，Anhui Science and Technology University，Fengyang 233100，China)

Objective：It aims to investigate the effects of different organic carbon sources on the production ofganodermic acid from liquid fermentation of Ganoderma lucidum. Method: Research on different concentrations of the corn flour,wheat flour,buckwheat powder,which influence the Mycelium dry weight,yield of ganoderic acid and content of ganoderic acid form submerged fermentation of Ganoderma lucidum was done. Results:The Mycelium dry weight and yield of ganoderic acid in mycelia were up-regulated by 111% and 126%,respectively, compared with the control group when the concentration of corn flour was 4g/L in culture solution. The Mycelium dry weight and yield of ganoderic acid in mycelia were up-regulated by 73% and 87%,respectively, compared with the control group when the concentration of wheat flour was 10g/L in culture solution. The Mycelium dry weight and yield of ganoderic acid in mycelia were up-regulated by 97% and 115%,respectively, compared with the control group when the concentration of buckwheat powder was 7g/L in culture solution. The content of ganoderic acid in mycelia reached peak, being 23.538mg/g, when 4g/L of corn flour was added to medium. However, there is no significant difference in the yield of ganoderic acid between 4, 5,7 and 10g/L of wild corn flour. Conclusion: From the practical considerations, 4g/L of corn flour was selected to apply to further experiment.

Organic carbon source; Liquid fermentation; Ganoderma acid; Mycelium dry weight; Content; Yield

2015-07-20

安徽省自然科学基金(11040606M96)。

鲍锐(1992-)，男，安徽省六安市人，在读硕士研究生，主要从事灵芝液体发酵研究。*通讯作者：王松华，教授，E-mail：shwang70。

S641.3

A

1673-8772(2015)06-0071-06