压力作用下星形胶质细胞线粒体形态与功能异常的研究△

高凤娟 孙兴怀 张圣海 高凤 陈馨雅 武娜 吴继红



·基础研究·

压力作用下星形胶质细胞线粒体形态与功能异常的研究△

高凤娟＊孙兴怀 张圣海 高凤 陈馨雅 武娜 吴继红

目的 研究压力对视网膜星形胶质细胞(RA)的损伤作用及可能的线粒体机制，为进一步阐明青光眼视神经损害的复杂分子机制提供实验数据。方法 对体外培养的RA施加30 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)压力，模拟慢性高眼压。分别在加压后不同时间点观察细胞线粒体形态及活性氧(ROS)含量变化，并收集细胞，制备细胞匀浆，采用生物化学方法检测5个线粒体呼吸链复合物(MRCC)和总超氧化物歧化酶(SOD)、Cu/Zn-SOD及Mn-SOD的活性变化。结果 压力作用后，RA线粒体的分裂及ROS含量均增加；MRCC Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的活性下降，MRCCⅤ的活性随加压时间的延长逐渐升高；各型SOD活性均降低，但Mn-SOD活性下降最迅速、幅度最大。结论 压力可以引起RA线粒体形态和功能异常，导致RA内活性氧增加及抗氧化能力下降等损伤性变化。(中国眼耳鼻喉科杂志，2015，15：311-314， 317)

压力；星形胶质细胞；线粒体呼吸链复合物活性；线粒体分裂；活性氧；超氧化物歧化酶

视乳头筛板是青光眼视神经发生原发性损害的部位，然而在筛板中最早受累的不是神经轴突，而是视网膜星形胶质细胞(retina astrocytes, RA)[1-2]。越来越多的研究[3-4]表明，RA在青光眼视神经损害的发生、发展中起着至关重要的作用。已有报道[1,3, 5]表明，RA在压力作用下发生激活和移行，从而参与了青光眼视神经的损害过程。但压力作为一种直接的细胞损害因素，是否可以引起RA损伤？以何种机制损伤？鲜见报道。线粒体作为细胞的能量“加工厂”对各种损伤因素极为敏感，在细胞损伤、凋亡等病理过程中扮演了重要角色。本实验系统研究了压力对体外培养的RA中线粒体形态及功能的影响，明确压力对RA的损伤作用及可能的线粒体机制，为进一步阐明青光眼视神经损害的复杂分子机制提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 大鼠RA购自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。将RA以1×105个/孔的密度均匀铺于六孔板中。培养基为含有10% 胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的达尔伯克改良伊格尔(Dulbecco modified Eagle medium, DMEM)/F12，37 ℃、普通CO2培养箱中培养至完全贴壁，放入压力培养箱中，压力设置为30 mm Hg (1 mm Hg=0.133 kPa)，分别加压培养24、48、72、96、120 h，即为实验组。正常对照组仍放于普通CO2培养箱中培养。1.2 线粒体形态 在指定时间点取上述六孔板中的细胞，以4%多聚甲醛固定20 min，再加入MitoTracker Green FM(Invitrogen)，置室温孵育30 min，标记线粒体。4,6-二氨基-2-苯基吲哚(4,6-diamino-2-phenyl indol,DAPI)套染细胞核。LeicaSP8共聚焦显微镜下观察线粒体分裂、融合特点并扫描。

1.3 细胞活性氧检测 在指定时间点取上述六孔板中的细胞，吸除培养基，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)洗涤细胞2次，加入预先配制好的H2DCFDA探针染液(加入无酚红DMEM培养液使其终浓度为10 μmol/L，购自Molecular Probes)，置室温孵育45 min，洗涤细胞1次；加入无酚红DMEM培养液，荧光显微镜下观察细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平及细胞形态并拍照。采用Image Pro Plus软件定量分析实验组和对照组细胞的荧光强度。

1.4 细胞匀浆制备和蛋白抽提 将加压不同时间的细胞用预冷的PBS漂洗3遍后收集，每三孔为一个样本，加入匀浆介质(0.9% NaCl+1%苯甲基磺酰氟)制备成10%的细胞匀浆。超声破碎仪冰上裂解上述细胞后4 ℃离心(2 000 r/min，10 min)，将上清液转移到0.5 mL的离心管中。根据二喹啉甲酸(bicinchoninic acid)蛋白测定试剂盒说明书测定样品蛋白浓度。

2 结果

2.1 压力作用后线粒体分裂增多 正常对照组中，RA线粒体成线状或网状结构(图1A)。30 mm Hg压力作用24 h后，线粒体片段化逐渐增多，48 h观察到线粒体形态以片段或碎片为主，并一直持续至120 h实验结束(图1B)。

图1. 绿色荧光标记为线粒体 A、B分别为正常对照组及实验组加压培养48 h后的RA线粒体形态改变

2.2 压力引起RA内ROS增加 与正常对照组相比，实验组压力作用48 h后，RA内代表ROS含量的绿色荧光亮度增强(图2A)，实验组较对照组ROS含量增多，差异具有统计学意义(P=0.013，P<0.05)(图2B)。

图2. A.显示对照组及实验组加压培养48 h后RA内ROS含量变化，绿色荧光标记为ROS，蓝色荧光标记为细胞核；B.为定量分析2组ROS含量变化(*示P<0.05)

2.3 压力作用后MRCC的动态变化 30 mm Hg压力作用下不同时间点的MRCC活性见表1。其中，MRCCⅠ、Ⅲ和Ⅳ的活性在加压24 h即开始下降，与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)，直到120 h实验结束。MRCCⅡ活性虽在加压48 h时检测到一过性轻度升高，但随后活性逐渐下降，到120 h时已经显著下降了55.08%(P<0.01)。而MRCCⅤ活性却随加压时间的延长逐渐升高，到120 h时较正常对照组升高了6.69倍(P<0.001)(图3)。

2.4 压力作用后细胞SOD的动态变化 SOD分Cu/Zn-SOD和Mn-SOD两型。结果表明，加压培养后各型SOD活性均降低。各组、各类型SOD活性见表2。Cu/Zn-SOD活性在加压培养96 h时降至最低，活性下降了37.58%(P<0.01)；Mn-SOD活性在加压后迅速大幅降低，48 h即下降了78.36%(P<0.001)，之后虽有小幅回升，但在120 h时仍较对照组降低了61.98%(P<0.001)。总SOD(T-SOD)活性在48 h时达最低，随后维持在低活性状态，直至120 h实验结束(图4)。

表1 MRCC Ⅰ～Ⅴ的活性(μmol·min-1·mg-1)

注：各组中5个MRCC在不同时间点的活性，加压培养不同时间后，与正常对照组比较，a示P<0.05，b示P<0.01，c示P<0.001

图3. 体外加压培养的RA 5个MRCC在加压不同时间后的活性变化 A-E分别为复合物Ⅰ～Ⅴ的活性变化；与对照组相比，*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001

表2 SOD活性(U/mgprot)

注：各组在不同时间点的SOD活性；与正常对照组比较，a示P<0.05，b示P<0.01，c示P<0.001

图4. RA加压培养不同时间后的SOD活性变化 A. T-SOD活性变化，B. Cu/Zn-SOD活性变化，C. Mn-SOD活性变化；与对照组相比，*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001

3 讨论

RA主要分布于视神经筛板及视网膜的神经纤维层和神经节细胞层，在高眼压性青光眼视神经损伤中发挥重要作用。本研究以体外加压(30 mm Hg)培养的方式模拟高眼压，旨在从线粒体形态和功能角度探索高眼压时压力本身对RA的损伤及其可能的机制。

活细胞中线粒体形态依赖于线粒体融合与分裂的动态平衡，与线粒体功能密切相关[6]。本实验结果显示，RA在压力作用下线粒体形态发生显著改变，由正常的线状或网状结构变成以碎片状为主，提示线粒体分裂增多、融合减少。这与我们以往研究[7]发现的压力使原代培养的成人视网膜色素上皮细胞中线粒体分裂增多相一致。目前已知，线粒体分裂增多可以引起线粒体功能障碍，从而导致细胞凋亡[8-10]。因此本实验结果提示，压力可以通过线粒体分裂增加引起RA损伤甚至死亡。另外，实验发现，压力作用下细胞内ROS增加，MRCC Ⅰ～Ⅳ活性降低，表明MRCC功能出现异常。MRCC Ⅰ在加压24 h下降后又逐渐升高，考虑是线粒体为抵抗损伤而产生的自身代偿作用。但因为损伤因素——压力的持续存在，MRCC Ⅰ活性始终显著低于正常对照组。MRCC Ⅰ与其他MRCC改变不一致的原因可能是其对压力损伤更为敏感，活性下降迅速。同时MRCC Ⅰ又表现出在短时间内有回升的趋势，提示它具有强大的代偿能力。这些结果均提示，MRCC Ⅰ是压力作用下线粒体损伤的一个重要部位，为进一步研究压力损伤细胞线粒体的机制提供线索，有可能成为神经保护的一个新的治疗靶点。有趣的是，我们发现MRCC Ⅴ(又称ATP合成酶)与其他4个复合物相反，在加压后活性不仅未见下降，反而显著升高，其原因可能有以下3点。①在MRCC Ⅰ～Ⅳ活性下降的情况下，细胞通过MRCC Ⅴ代偿性升高试图恢复线粒体功能。②MRCC Ⅰ～Ⅳ相互之间可以形成超复合体，活性改变相对一致；而MRCC Ⅴ单独存在，受另外4个复合物的影响较小，容易自身发生代偿性升高。③MRCCⅤ在线粒体内膜上的位置距离ROS的产生部位相对较远，不易受ROS损伤。当细胞受损、功能障碍时，其活性代偿性增加，为细胞提供更多的能量。

SOD是视网膜抗氧化系统的主要成分之一，细胞内的SOD分两型：Cu/Zn-SOD和Mn-SOD。前者主要位于细胞质内，而后者主要位于线粒体基质内，是线粒体内清除自由基的最重要抗氧化酶。因此，检测SOD活性可以很好地反映机体抗氧化系统的损伤情况。本实验结果表明，RA加压培养后，SOD活性均降低，而以Mn-SOD活性下降最显著且最迅速。有研究[11-12]显示，敲除线粒体内Mn-SOD基因的小鼠出生后10 d内即死亡，但敲除细胞质中Cu/Zn-SOD基因的小鼠则安然无恙。因此，Mn-SOD在线粒体的抗氧化系统中起着非常基础且重要的作用。又加之其在线粒体内的含量非常低，因此当Mn-SOD活性下降后，将对线粒体的抗氧化能力产生严重影响，致其功能障碍甚至崩解[13]。本实验结果提示，压力对线粒体内抗氧化系统的损伤均较早、较严重，导致线粒体内很早即出现氧化应激损伤，进而导致细胞损伤、功能障碍。

以往的实验大多围绕压力引起RA激活和移行这一科学问题进行研究[3,14]。本实验发现，压力可以引起RA线粒体形态和功能异常、活性氧增加及抗氧化能力下降等损伤性变化，是对压力下RA改变的一个重要补充，为深入研究青光眼视神经损害的病理机制提供了实验依据。

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(本文编辑 诸静英)

Research on changes of mitochondria morphology and function under high pressure in rat astrocytes

GAOFeng-juan,SUNXing-huai,ZHANGSheng-hai,GAOFeng,CHENXin-ya,WUNa,WUJi-hong.
DepartmentofOphthalmology,EyeEarNoseandThroatHospitalofFudanUniversity,Shanghai200031,China

WU Ji-hong, Email: jihongwu@fudan.edu.cn

Objective To investigate the damage of high pressure on retina astrocytes (RA) mitochondria and to explore the underlying mitochondrial mechanisms for further clarification of the complex molecular mechanisms of glaucoma optic nerve damage. Methods RA were cultured under 30 mm Hg pressure to mimic ocular chronic hypertension. Mitochondrial morphology and reactive oxygen species (ROS) level were observed by using the corresponding fluorescent probe at different time point. Mitochondrial complex and SOD activities were detected by biochemistry methods. Results The division of mitochondria and mount of ROS production both increased under high pressure. The activity of mitochondrial complex Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ all declined while mitochondrial complex Ⅴincreased with the prolonging of pressurization time.T-SOD, Cu/Zn-SOD and Mn-SOD activities all decreased, whereas Mn-SOD activities declined earliest and most significantly. Conclusions High pressure causes mitochondria morphology change and directly leads to mitochondrial dysfunction, resulting in the increase of ROS production and reduction of antioxidation ability in rat astrocytes.(Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2015,15:311-314, 317)

Pressure; Astrocytes; Mitochondrial respiratory chain complex activity; mitochondrial fission; Reactive oxygen species; Superoxide dismutase

国家自然科学基金(NSFC81470624, NSFC81470625)；上海市卫生局局级科研项目(20124073)

复旦大学附属眼耳鼻喉医院眼科 上海 200032；＊上海市第六人民医院眼科 上海 200030

吴继红(Email：jihongwu@fudan.edu.cn)

10.14166/j.issn.1671-2420.2015.05.003

2014-12-15)