大黄素激活AMPK、PPARγ对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响

洪海棉，谢秀利，洪桂祝，赖文芳

（福建中医药大学药学院，福建福州 350122）

大黄素激活AMPK、PPARγ对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响

洪海棉，谢秀利，洪桂祝，赖文芳

（福建中医药大学药学院，福建福州 350122）

中国图书分类号：R-332；R284．1；R329．24；R343．23；R587．1

摘要：目的 研究大黄素对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响，并探讨其作用机制。方法 诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞经LPS干预后分为Control组、大黄素给药组（1、10、50 μmol·L－1），检测6-NBDG摄取情况及GLUT4、PPARγ、AMPKα1／2、p-AMPKα1／2、IRS-1、p-IRS-1、Adiponec-tin、chREBP-α和chREBP-β的表达。用AMPK和PPARγ抑制剂分别干预后，检测6-NBDG的摄取情况。同时，以STZ诱导大鼠2型糖尿病模型，分为Control组和大黄素给药组，检测大鼠内脏脂肪组织的Adiponectin的mRNA表达及GLUT4、AMPKα1／2、p-AMPKα1／2蛋白表达。结果 与Con-trol组相比，大黄素可促进GLUT4、Adiponectin、chREBP-α、chREBP-β的mRNA表达及GLUT4、PPARγ、IRS-1、p-IRS-1、AMPKα1／2和p-AMPKα1／2的蛋白表达（P＜0.05），可提高3T3-L1脂肪细胞对6-NBDG的摄取，经AMPK及PPARγ抑制剂分别干预后，大黄素对6-NBDG的摄取降低（P＜0.05）。同时，大黄素可促进T2DM大鼠内脏脂肪组织Adiponectin的mRNA表达及GLUT4、AMPKα1／2和p-AMPKα1／2的蛋白表达（P＜0.05）。结论 大黄素可促进3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取功能，其作用机制与激活Adiponectin及IRS-1，进而激活AMPK和PPARγ的信号通路有关。

关键词：大黄素；2型糖尿病；葡萄糖摄取；3T3-L1细胞；葡萄糖转运体4；AMPK；PPARγ

网络出版时间：2015－10－16 9：52 网络出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20151016．0952．036．html

大黄是蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L．、唐古特大黄Rheum tanguticum’Maxim．ex Balf．或药用大黄Rheum officinale Baill．的干燥根和根茎，2010版中国药典介绍大黄具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、利湿退黄的功效。大黄素（emodin）是大黄的主要有效成分之一，有研究发现大黄素具有抗炎、降糖、降脂等作用，并能改善胰岛素抵抗，具有治疗2型糖尿病（type 2 diabetes melli-tus，T2DM）的潜在价值［1－3］。

葡萄糖转运体4（glucose transporter type 4，GLUT4）是脂肪细胞和肌细胞摄取葡萄糖的重要转运体［4］，并受AMP依赖的蛋白激酶［adenosine 5’-monophosphate（AMP）-activated protein kinase，AMPK］和过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxi-some proliferator-activated receptor γ，PPARγ）的调控。激活AMPK或PPARγ均可促进细胞编码GLUT4基因和GLUT4蛋白向细胞膜转位，是治疗T2DM的重要靶点［5－7］。课题组前期发现，大黄素对链脲佐菌素（STZ）诱导T2DM大鼠的胰岛素有增敏作用，并明显上调T2DM大鼠皮下脂肪组织细胞膜上GLUT4蛋白的表达［8］，但对其药理作用的分子机制尚不明确。本研究进一步从AMPK和PPARγ途径探讨大黄素对脂肪细胞葡萄糖摄取的作用机制。

1　材料

1．1实验动物与细胞株 ♂Wistar大鼠［上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2012－0002］，由福建中医药大学实验动物中心饲养；小鼠3T3-L1成纤维细胞（中国科学院上海生命科学研究院）。

1．2药品与试剂 大黄素（纯度≥98%，陕西森弗生物技术有限公司，货号：20111120006）；Rever-taid First Strand cDNA Synthesis Kit（美国Fermentas公司）；RNeasyMini Kit（德国Qiagen公司，货号：74104）；6-NBDG（Sigma-Aldrich，货号：72987）；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（上海碧云天生物技术研究所）；GW9662（Sigma-Aldrich公司，货号：M6191）；Compound C（Sigma-Aldrich公司，货号：P5499）；抗体AMPKα1／2（Santa Cruz公司，货号：sc-25792）、p-AMPKα1／2（Santa Cruz公司，货号：sc-33524）、PPARγ（Santa Cruz公司，货号：sc-7273）、GLUT4 （Santa Cruz公司，货号：sc-7938）、IRS-1（Santa Cruz公司，货号：sc-559）和p-IRS-1（Santa Cruz公司，货号：sc-33956）；小鼠18S rRNA探针引物（货号：4319413E，Applied Biosystems）。

1．3仪器 凝胶成像分析系统（Bio-Rad，型号：ChemiDoc XRS＋），PCR仪（Bio-Rad，型号：C1000），荧光定量PCR仪（Applied Biosystems，型号：7900HT），高速台式冷冻离心机（Thermo Fisher，型号：Primo R）。

2　方法

2．1细胞诱导及处理方法 3T3-L1前脂肪细胞接种到24孔板中，培养于37℃、5%CO2培养箱中。用第1诱导液（10%胎牛血清和1%双抗的高糖DMEM，0.5 mmol·L－1异丁基甲基黄嘌呤，1.0 mg ·L－1胰岛素和1.0 μmol·L－1地塞米松）培养细胞48 h，更换为第2诱导液（10%胎牛血清和1%双抗的高糖DMEM，1 mg·L－1胰岛素）培养16 d，采用油红O染色法染色观察细胞内有油滴聚集，即表示3T3-L1细胞已诱导分化为成熟的脂肪细胞。经10 μg·L－1LPS干预24 h后，实验分为Control组、Emodin给药组（1、10、50 μmol·L－1），收集细胞检测各项指标。同时，3T3-L1脂肪细胞经10 μg·L－1LPS干预24 h，分为Control组、Emodin组、GW9662 （5 μmol·L－1）＋Emodin组、Compound C（10 μmol ·L－1）＋Emodin组。各组加入20 μmol·L－1葡萄糖类似物6-NBDG培养30 min。吸去培养液，用PBS洗涤细胞3遍，加入含1%曲通X-100的0.1 mol·L－1pH 10磷酸钾缓冲液70 μL，避光裂解细胞10 min后，加入30 μL DMSO，轻轻摇动，使其与裂解液充分混匀后，用激发波长466 nm和发射波长540 nm荧光检测每孔荧光强度。

2．2动物造模及处理方法 STZ诱导T2DM模型的方法参照Lai等［9］的报道。♂Wistar大鼠（200± 20）g经适应性喂养后，改换高脂饲料饲养6周。经腹腔注射25 mg·kg－1STZ，4周后检查大鼠空腹血糖（FBG）水平，FBG＞7.8 mmol·L－1的大鼠视为T2DM模型。实验大鼠随机分为Control组和大黄素给药组，给药组每天灌胃大黄素100 mg·kg－1，Control组灌胃等体积的0.5%Na-CMC，连续灌胃21 d，并观察大鼠每天的体重变化和进食情况。d 21取内脏脂肪组织进行后续实验。

2．3Real-time PCR检测mRNA的表达 按照QIAGEN RNeasyMini Kit试剂盒的操作步骤提取动物组织或细胞总RNA，用Revertaid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行逆转录为cDNA。PCR反应以cDNA为模板，反应条件为50℃2 min，95℃预变性15 s，退火60℃30 s，40个循环。每个实验重复处理3批样品，每批样品分别以同一批样品的内参计算ΔΔCt，以2－ΔΔCt计算各组mRNA的表达量。ΔΔCt＝各组（Ct目的基因－Ct内参）－对照组（Ct目的基因－Ct内参）。PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司参照GenBank合成。引物序列详见Tab 1。

Tab 1 Sequences of primers for Real-time PCR

2．4Western blot法检测蛋白的表达 用含1% PMSF的RIPA裂解液裂解动物组织或细胞，离心取上清液，用BCA法检测蛋白浓度，加1×上样缓冲液，100℃变性10 min。用SDS-PAGE凝胶进行电泳、转膜、封闭、4℃孵育一抗过夜，TBST洗膜3遍后，孵育二抗2 h，用Bio-Rad凝胶成像系统进行ECL显影。

2．5统计学处理 实验数据用SPSS 20．0软件进行统计分析，所有结果以±s表示，组间比较采用Student-t检验或one-way ANOVA进行统计。

3　结果

3．1油红O染色观察诱导分化的3T3-L1脂肪细胞 诱导分化后的3T3-L1细胞，体积变大，多呈圆形，胞质内容丰富，用油红O染色可见红色脂滴富集细胞核周（Fig 1）。表明3T3-L1脂肪细胞已经诱导分化成熟。

Fig 1 Differentiated 3T3-L1 adipocytes strained by oil red O（scale bar＝50 μm）

3．2大黄素对3T3-L1脂肪细胞的细胞膜GLUT4

及细胞摄取6-NBDG的影响 与Control组相比，大黄素给药组明显提高3T3-L1脂肪细胞对6-NBDG的摄取，并提高细胞膜上GLUT4的mRNA及蛋白表达水平，且差异有显著性（P＜0.05）（Fig 2）。

Fig 2 Emodin enhanced 6-NBDG uptake（A）and mRNA（B）and protein（C）expression of cell surface GLUT4 in 3T3-L1 adipocytes（n＝3）

3．3大黄素对3T3-L1脂肪细胞Adiponectin、chREBP-α和chREBP-β的mRNA表达及IRS-1、p-IRS-1蛋白表达的影响 与Control组相比，大黄素给药组可提高3T3-L1脂肪细胞Adiponectin、chREBP-α和chREBP-β的mRNA表达（P＜0.05）。同时，大黄素给药组也提高了3T3-L1细胞IRS-1蛋白磷酸化水平，且差异有显著性（P＜0.05），见Fig 3。

3．4大黄素对3T3-L1脂肪细胞AMPKα1／2、p-AMPKα1／2蛋白表达的影响，及经AMPK抑制剂作用后对6-NBDG摄取的影响 与Control组相比，大黄素给药组可提高3T3-L1脂肪细胞AMPKα1／2蛋白磷酸化水平，且差异有显著性（P＜0.05）。同时，与Control组相比，大黄素给药组可提高3T3-L1脂肪细胞对6-NBDG的摄取。与Emodin组相比，Compound C组降低细胞对6-NBDG的摄取，而Com-pound C＋Emodin组3T3-L1脂肪细胞对6-NBDG的摄取也降低（P＜0.05），见Fig 4。

3．5大黄素对3T3-L1脂肪细胞PPARγ蛋白表达的影响，及经PPARγ抑制剂作用后对6-NBDG摄取的影响 与Control组相比，大黄素给药组可提高3T3-L1脂肪细胞PPARγ蛋白表达水平，且差异有显著性（P＜0.05）。同时，与Control组相比，大黄素给药组可提高3T3-L1脂肪细胞对6-NBDG的摄取。与Emodin组相比，GW9662组降低细胞对6-NBDG的摄取，而GW9662＋Emodin组3T3-L1脂肪细胞对6-NBDG的摄取也降低（P＜0.05），见Fig 5。

3．6大黄素对T2DM大鼠脂肪组织细胞膜GLUT4蛋白及Adiponectin的mRNA表达的影响与Control组相比，Emodin组可提高T2DM大鼠脂肪组织细胞膜上GLUT4的蛋白表达和Adiponectin 的mRNA表达，且差异有显著性（P＜0.01），见Fig 6。

3．7大黄素对T2DM大鼠脂肪组织AMPKα1／2、p-AMPKα1／2的蛋白表达的影响 与Control组相比，Emodin组可提高T2DM大鼠的AMPKα1／2的蛋白磷酸化水平，且差异有显著性（P＜0.01），见Fig 7。

4　讨论

脂肪细胞是全身能量与代谢的关键调节者［10］。当血糖浓度升高时，胰岛素诱导脂肪细胞摄取葡萄糖转化为脂质。T2DM患者由于肝脏、脂肪和肌肉等组织的胰岛素抵抗，导致血糖持续升高［11］。因此，增加脂肪细胞的胰岛素敏感度和葡萄糖摄取是治疗T2DM的手段之一。

Fig 3 Emodin enhanced mRNA expression of Adiponectin（A），chREBP-α（C），chREBP-β（D）and protein expression of p-IRS-1／total IRS-1（B）in 3T3-L1 adipocytes（n＝3）

Fig 4 Emodin enhanced protein expression of p-AMPK／total AMPK（A）and enhanced 6-NBDG uptake and uptake was inhibited by compound C（B）in 3T3-L1 adipocytes（n＝3）

Fig 5 Emodin enhanced protein expression of PPARγ（A）and enhanced 6-NBDG uptake and uptake was inhibited by GW9662（B）in 3T3-L1 adipocytes（n＝3）

Fig 6 Emodin enhanced protein expression of cell surface GLUT4（A）and mRNA expression of Adiponectin（B）in adipose tissue of T2DM rats（n＝4）

Adiponectin是内源性胰岛素增敏激素［12］，IRS-1是胰岛素受体的底物之一［13］，大黄素能够促进二者的表达，提示大黄素可通过激活Adiponectin和IRS-1，提高3T3-L1脂肪细胞对胰岛素的敏感度。chREBP-α和chREBP-β是体内脂肪生成和糖分解的转录调控因子［10］，chREBP的激活可促进葡萄糖向脂质转化。本实验研究结果显示，大黄素的降糖作用可能通过激活脂肪细胞chREBP的转录和促进脂肪细胞表面葡萄糖转运体GLUT4的葡萄糖转运实现的。同时，大黄素可激活3T3-L1脂肪细胞AMPKα1／2和PPARγ的表达，并且经AMPK和PPARγ抑制后，大黄素对3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取作用的影响明显减弱，表明大黄素促进3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的摄取与AMPK和PPARγ的信号通路有关。

综上所述，大黄素可增加3T3-L1脂肪细胞的胰岛素敏感度，促进3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取功能，发挥降血糖作用，其作用机制与激活Adiponectin 及IRS-1，进而激活AMPK和PPARγ的信号通路有关。

Fig 7 Emodin enhanced protein expression of p-AMPK／total AMPK in adipose tissue of T2DM rats（n＝4）

（致谢：本实验在福建省中药学重点实验室完成，感谢实验室的老师对本实验的帮助与指导。）

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Activation of AMPK and PPARγ by emodin influences glucose uptake in 3T3-L1 adipocytes

HONG Hai-mian，XIE Xiu-li，HONG Gui-zhu，LAI Wen-fang
（College of Pharmacy，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350122，China）

Abstract：Aim To investigate glucose uptake effects and mechanism of emodin in 3T3-L1 adipocytes．Methods LPS-induced differentiated 3T3-L1 adipo-cytes were divided into control group and emodin（1，10，50 μmol·L－1）groups．Then，6-NBDG uptake and the expression of cell surface GLUT4，PPARγ，AMPKα1／2，p-AMPKα1／2，IRS-1，p-IRS-1，Adi-ponectin，chREBP-α and chREBP-β were detected．The ability of 6-NBDG uptake in LPS-induced 3T3-L1 adipocytes was also evaluated following interference with AMPK inhibitor and PPARγ inhibitor，respective-ly．Meanwhile，STZ-induced diabetic rats were ran-

domly divided into control group and emodin treatment group．The mRNA expression of Adiponectin and pro-tein expression of cell surface GLUT4，AMPKα1／2，p-AMPKα1／2 were measured．Results Compared with the control group，emodin improved the mRNA expres-sion of cell surface GLUT4，Adiponectin，chREBP-α and chREBP-β，and protein expression of cell surface GLUT4，PPARγ，IRS-1，p-IRS-1，AMPKα1／2 and p-AMPKα1／2 in 3T3-L1 adipocytes（P＜0.05）．Emodin enhanced 6-NBDG uptake and the uptake of emodin group was both decreased following interference with AMPK inhibitor and PPARγ inhibitor，respectively（P＜0.05）．Emodin also increased the mRNA expression of Adiponectin and protein expression of cell surface GLUT4，AMPKα1／2 and p-AMPKα1／2 in adipose tis-sue of T2DM rats（P＜0.05）．Conclusion Emodin can enhance glucose uptake in 3T3-L1 adipocytes and the mechanism is probably associated with activating Adiponectin and IRS-1，thereby activating AMPK and PPARγ．

Key words：emodin；type 2 diabetes mellitus；glucose uptake；3T3-L1 cells；glucose transporter type 4；AMPK；PPARγ

作者简介：洪海棉（1990－），男，硕士生，研究方向：药理学，E-mail：xwzcghappy＠163．com；赖文芳（1985－），女，硕士，助理研究员，研究方向：药理学，通讯作者，E-mail：laiwenfang08＠163．com

基金项目：福建省自然科学基金资助项目（No 2015J01328）；福建中医药大学校管课题（No X2015013-平台）

收稿日期：2015－06－18，修回日期：2015－07－14

文献标志码：A

文章编号：1001－1978（2015）11－1569－07

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．11．018