响应面优化黄色蚕茧超声辅助酶法脱胶工艺

邵双双，贺亮，韦朝阳，李卫旗*

(1.浙江大学生命科学学院，杭州310058；2.浙江省林业科学研究院生物技术所，杭州310023)

响应面优化黄色蚕茧超声辅助酶法脱胶工艺

邵双双1，贺亮2，韦朝阳1，李卫旗1*

(1.浙江大学生命科学学院，杭州310058；2.浙江省林业科学研究院生物技术所，杭州310023)

对黄色蚕茧超声辅助酶法脱胶工艺进行研究。在单因素实验的基础上，选择对蚕茧脱胶率有显著影响的3个因素：pH(X1)、酶加量(X2)、超声功率(X3)，进行三因素三水平的响应面分析实验。最终确定最优条件为：pH5.5、酶加量5.5%(E/S)、超声功率390W、超声处理时间35min、温度60℃、料液比1∶30(m/v)。并且该最佳条件下脱胶率(37.62±0.34%)和脱下的丝胶蛋白DPPH自由基清除率(IC502.41±0.078 mg/mL)、类胡萝卜素含量(0.34±0.038 mg/g)和黄酮含量(0.59±0.062 mg/g)均高于水浴煮沸脱胶和酶法脱胶，进一步表明了超声辅助酶法脱胶的优越性。

黄色蚕茧；脱胶；超声波；酶法；响应面

目前，超声波处理技术广泛应用于食品、医药、化工等领域。超声辅助酶解制备中的应用主要是通过超声波能量作用于反应体系改变各个组成部分的作用方式，提高产物的合成效率来实现的[1]。蛋白酶是一种无毒无害、高效环保的生物催化剂，用蛋白酶对蚕茧脱胶已经是脱胶工艺发展的重点，其中木瓜蛋白酶对蚕茧脱胶的综合效果最好[2]。

天然彩色蚕茧色素主要来源于桑叶或蚕体内自身的合成，主要包含类胡萝卜素，且其茧层中还含有叶黄素、黄酮、丝胶蛋白等活性物质。国内对彩色茧提取物抑菌活性及其抗氧化活性的研究也越来越多[3-4]，而且丝胶作为食品、化妆品添加剂也具有重要的应用价值，天然彩色蚕茧的利用不仅对人们健康有益，而且符合当前消费新理念[5]。

目前，国内对超声辅助酶解法提取的研究越来越多[6-7]，但对天然黄色茧脱胶工艺的研究比较少。所以对黄色蚕茧超声辅助酶法脱胶工艺进行响应面优化，并对脱胶后丝胶蛋白DPPH自由基清除率及其类胡萝卜素和黄酮含量进行测定，为黄色蚕茧的深度开发和综合利用提供科学依据，使其更好服务于人类生活。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄色蚕茧下脚料湖州农科院；木瓜蛋白酶(≥3units/mg)，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 购自上海阿拉丁试剂公司；其它试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

KQ-500DB型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；HHS型电热恒温水浴锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂出品；Sartorius BSA224S型电子分析天平 北京赛多利斯科学仪器有限公司；U-1900型可见分光光度计 日本HITACHI公司。

1.3 试验方法

1.3.1 脱胶率计算[8]。将脱胶前后的蚕茧烘干后放入玻璃干燥器中，于室温下平衡30 min后称得的质量为脱胶前后的干质量，脱胶率计算如式：

1.3.2 超声波辅助酶法脱胶单因素实验。分别以不同的超声处理时间、料液比、温度、pH、酶加量及超声功率为单因素，考察各单因素对黄色蚕茧脱胶率的影响。单因素基础实验条件是：超声处理30 min，温度50℃，pH为6，酶加量为1%(E/S)，料液比为1∶40(m/v)，超声功率为200W，脱胶1 h。各因素取值范围：超声时间20、25、30、35、40、45 min；温度40、50、60、70、80℃；pH 3、4、5、6、7、8；酶加量1%、3%、4%、5%、6%、7%(E/S)；料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60(m/v)；超声功率为200、250、300、400、500W。脱胶完成后，将蚕茧取出用 40℃左右的去离子水洗涤3次，并在105℃烘箱内烘干至恒重，计算脱胶率。

1.3.3 超声波辅助酶法脱胶单因素实验。 在单因素实验基础上，选择对脱胶率影响显著的pH、酶加量和超声功率3个因素，以脱胶率为响应值，通过响应面法(Response Surface Method，RSM)进行提取条件的优化，并运用design-expert 8.0软件分析得到最优制备条件。实验因素和水平如表1。

表1 Box-Behnken实验因素及水平

1.3.4 超声波辅助酶法与传统法对黄色蚕茧脱胶比较

1.3.4.1 水浴煮沸脱胶[9]。称取50g的黄色蚕茧，置于料液比1∶40(m/v)的蒸馏水中，调节pH为7，在电热恒温炉中加热煮沸脱胶1h后，取出用 40℃左右的去离子水洗涤3次，在105℃烘箱内烘干至恒重，计算脱胶率。洗涤液与原脱胶液混合，离心(2000 r/min，10 min)，浓缩，干燥得丝胶蛋白粉末。

1.3.4.2 酶法脱胶[10]。称取50 g的黄色蚕茧，置于料液比为1∶40(m/v)，温度50℃，质量分数1%(E/S)的木瓜蛋白酶溶液，调节pH为7，脱胶1 h后，取出用 40℃左右的去离子水洗涤3次，蚕茧在105℃烘箱内烘干至恒重，计算脱胶率。洗涤液与原脱胶液混合，灭酶，离心(2000 r/min，10 min)，浓缩，干燥得丝胶蛋白粉末。

1.3.4.3 超声辅助酶法脱胶。称取50g的黄色蚕茧，在响应面优化后的条件下脱胶，总脱胶时间为1 h，蚕茧取出用40℃左右的去离子水洗涤3次，在105 ℃烘箱内烘干至恒重，计算脱胶率。洗涤液与原脱胶液混合，灭酶，离心(2000 r/min，10 min)，浓缩，干燥得丝胶蛋白粉末。

1.3.5 最优条件下得到的丝胶蛋白与传统法得到的丝胶蛋白比较

1.3.5.1 丝胶蛋白DPPH自由基清除率测定[11]。1.0 mL DPPH(0.2 mM)与1.0 mL的样品混匀，室温静置30 min，于517 nm处测定吸光值。

A0为空白样品吸光值，As加样后的吸光值，Aj为以蒸馏水代替DPPH的吸光值

1.3.5.2 类胡萝卜素含量测定[12]。称取丝胶蛋白粉0.5g于三角瓶中，用30倍体积的石油醚：丙酮(1∶1，v/v)浸提3次，过滤，合并滤液，定容到一定体积，在450nm处测吸光值，计算丝胶蛋白中类胡萝卜素含量。

式中：X为类胡萝卜素含量，A为450 nm处吸光值，y为提取液总体积，A1为胡萝卜素平均吸收系数，g是丝胶蛋白的重量。

1.3.5.3 黄酮含量测定。采用硝酸铝显色法进行黄酮含量的测定。根据文献[13]方法制作芦丁标准曲线，回归得到吸光度A与黄酮浓度C的线性方程：A=10.70469C-0.03996，相关系数R=0.9992。

取丝胶蛋白粉末0.5g放入试管中，加入75%乙醇至10 mL，超声30 min，再放入60℃水浴锅里抽提1 h，过滤去除杂质，收集抽提液，定容于25 mL标准容量瓶。取样液5 mL，加入质量分数5%亚硝酸钠溶液0.5 mL，混匀。放置6 min，加入质量分数10%的硝酸铝溶液0.5 mL，混匀，放置6 min；最后加入质量分数4%氢氧化钠溶液2.5mL，用75%乙醇定容至10 mL，放置15min后，在510 nm波长处测定吸光度A。根据芦丁标准曲线计算出样品黄酮含量。

2 结果与分析

2.1 超声波辅助酶法脱胶单因素实验

2.1.1 超声时间对黄色蚕茧脱胶率的影响

图1 超声处理时间对脱胶率的影响

由图1可以看出，在超声处理20～45 min时间内，蚕茧脱胶率变化不大。当超声处理35 min时，脱胶率达到最大为32.79%±0.21%；当超声时间为40 min后，脱胶率缓慢下降，这可能是因为超声波处理使得底物空间结构发生改变，减少了底物与水解酶的结合位点，进而降低了反应速度[14]。综合考虑生产成本和脱胶后蛋白活性等因素影响，可以选择超声处理时间为35 min来进行后续实验。

2.1.2 温度对黄色蚕茧脱胶率的影响

图2 温度对脱胶率的影响

从图2可以看出，本实验中蚕茧在40～80℃范围内随温度升高脱胶率也升高。在80℃时脱胶率为36.27%±0.26%，说明木瓜蛋白酶对温度具有宽泛的耐受特性，因此木瓜蛋白酶可高温脱胶也可低温脱胶，这与邓一民等报道的结果类似[15]。综合考虑生产成本和对脱胶蛋白活性等因素的影响，选择温度为60℃来进行后续实验。

2.1.3 pH对黄色蚕茧脱胶率的影响

图3 pH对脱胶率的影响

由图3可知，在pH3～8范围内，pH值为6时脱胶率最高达33.79%±0.27%，超过此pH值，蚕茧脱胶率下降，因为酶活力受环境的影响，pH不仅影响酶的构象，而且也影响底物的解离状态[16]。pH值为6时，木瓜蛋白酶处于最佳pH值区间，能够发挥木瓜蛋白酶的最大活力，因此可以选择pH为5、6、7三个水平进行后续优化实验。

2.1.4 酶加量对黄色蚕茧脱胶率的影响

图4 加酶量对脱胶率的影响

从图4可以看出，酶加量从1%～5%(E/S)上升时，黄色蚕茧脱胶率也随之上升，当酶加量在5%～8%(E/S)范围内，脱胶率变化不大。酶量越多，酶与底物作用越充分[17]，但当酶与底物的结合接近饱和时，过量的酶就不再使脱胶效果明显提高。因此，确定酶加量为4%、5%、6%(E/S)三个水平进行后续优化较为合适。

2.1.5 料液比对黄色蚕茧脱胶率的影响

图5 料液比对脱胶率的影响

由图5可知，在料液比为1∶20～1∶50(m/v)蚕茧脱胶率变化不大，料液比为1∶30(m/v)，脱胶率最大。这可能是由于丝胶蛋白本身易溶于水，加水量越多，丝胶蛋白溶解速率越快，但是酶与底物接触减少，作用减少，导致脱胶率增长减慢，甚至减小[18]。因此，实验中可选取料液比为1∶30(m/v)来进行后续的响应面分析实验。

2.1.6 超声功率对黄色蚕茧脱胶率的影响

由图6可知，超声功率在400W 时，脱胶率最大，在200～400W时，蚕茧脱胶率随着功率的增大而明显增大，但在400W之后，脱胶率减小。这可能是由于随着超声功率的增加，作用在底物上的超声能增加，加快了丝胶蛋白的的溶解，但过高的功率可能破坏酶的活性中心，导致整体脱胶效果减小[19]。因此实验中可选取300、400、500 W进行后续的响应面分析实验。

图6 超声功率对脱胶率的影响

2.2 响应面结果与分析

根据单因素实验结果，最终选择对黄色蚕茧脱胶率有显著影响的三个因素：pH(X1)，酶加量(X2)，超声功率(X3)，进行三因素三水平的响应面分析实验。

实验结果见表2，利用Design Expert 8.0软件对表2数据进行多元回归拟合，得到脱胶率Y为目标函数的一次回归方程模型：Y=37.59-0.77X1+1.27X2-0.35X3-0.13X1X2+0.29X1X3+0.38X2X3-1.03X12-1.93X22-1.17X32。

表2 响应面实验设计及数据处理

对回归模型进行方差分析可以看出(表3)：模型Pr=0.0072<0.01，表明回归方程模型极显著；失拟项Pr=0.0633>0.05，不显著，表明该方程对实验拟合情况好、误差小；模型的调整确定系数R2=0.95474，表明方程模型与实验数据有95.474%的符合度。结合表3和图7～图9对模型进行回归方程系数显著性分析表明：模型中X2，X22为极显著项，X1，X12，X32为显著项，3个因素对脱胶率影响大小顺序为：X2>X1>X3，即pH>酶加量>超声功率。X1X2，X1X3，X2X3的Pr值大于0.05，且等高线为圆形，所以3个因素的交互作用对蚕茧脱胶率的影响不显著。

表3 回归分析结果

图7 pH和酶加量交互作用对脱胶率影响的响应面图

图8 pH和超声功率交互作用对脱胶率影响的响应面图

图9 超声功率和酶加量交互作用对脱胶率影响的响应面图

由模型预测得到的最佳优化条件为：pH为5.56，酶加量为5.44%(E/S)，超声功率为390.31W。该条件下蚕丝脱胶率的预测值为37.88%。考虑到实际操作的便利，确定最佳优化条件为：pH为5.5，酶加量为5.5%(E/S)，超声功率为390W，超声处理时间为35min，温度为60℃，料液比为1∶30(m/v)。为了检验方法可靠性，将上述最优工艺条件平行做3次实验，结果取均值。测得蚕丝脱胶率的为37.62%±0.34%，该值与理论预测值37.88%相比，其相对误差较小(约为0.69%)。

2.3 超声波辅助酶法与传统方法对黄色蚕茧脱胶比较

图10 超声波辅助酶法与传统法对黄色蚕茧脱胶比较

从图10可以看出，超声波辅助酶法脱胶率(37.62%±0.34%)高于水浴煮沸脱胶(19.8%±0.21%)和酶法脱胶(26.25%±0.22%)。说明超声辅助酶法脱胶要优于水浴煮沸脱胶和酶法脱胶。

2.4 不同方法脱胶后丝胶蛋白DPPH自由基清除率、类胡萝卜素和黄酮含量比较

超声辅助酶法脱胶(最优条件)、水浴煮沸法脱胶以及酶法脱胶方法得到的丝胶蛋白中类胡萝卜素和黄酮含量以及丝胶蛋白DPPH自由基清除率结果如表4。结果表明：DPPH自由基清除效果为：超声辅助酶法(IC502.41±0.078mg/mL)>酶法(IC502.97±0.036mg/mL)>水浴煮沸(IC505.85±0.047 mg/mL)；类胡萝卜素含量为：超声辅助酶法(0.34±0.038mg/g)>酶法(0.27±0.041 mg/g)>水浴煮沸(0.16±0.024 mg/g)；黄酮含量为：超声辅助酶法(0.59±0.062 mg/g)>酶法(0.51±0.045 mg/g)>水浴煮沸(0.32±0.076 mg/g)。

表4 丝胶蛋白类胡萝卜素和黄酮含量以及DPPH自由基清除率

3 结论

3.1 超声波辅助酶法脱胶率(37.62%±0.34%)高于水浴煮沸脱胶(19.8%±0.21%)和酶法脱胶(26.25%±0.22%)。说明超声辅助酶法对黄色蚕茧脱胶，比水浴煮沸法脱胶和酶法脱胶效果要好。

3.2 本文根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理，优化超声辅助酶法对黄色蚕茧脱胶的工艺，并建立了相应的数学模型。最后确定最佳工艺条件为：pH为5.5，酶加量为5.5%(E/S)，超声功率为390W，超声处理时间为35min，温度为60℃，料液比为1∶30(m/v)。该条件下蚕茧脱胶率为37.62%±0.34%，该值与理论预测值37.88%相比，其相对误差较小(约为0.69%)。研究结果表明，中心组合设计响应面法可优化工艺参数，为工业应用提供理论基础。

3.3 超声辅助酶法脱胶率(37.62%±0.34%)和脱胶后得到的丝胶蛋白DPPH自由基清除率(IC502.41±0.078 mg/mL)、类胡萝卜素含量(0.34±0.038 mg/g)和黄酮含量(0.59±0.062 mg/g)均高于水浴煮沸脱胶和酶法脱胶，进一步说明了超声辅助酶法脱胶的优越性。

[1]滕超,查沛娜,范园园,等.超声波在酶解制备技术中的应用进展[J].江苏农业科学,2014,42(6):13-16.

[2]丁欢,胡岚,龙莎,等.浅析多种蚕丝脱胶方法[J].中国纤检,2015(1):84-85.

[3]何秀玲,胡桂燕,钟石,等.不同高丝胶茧蚕品种的丝胶蛋白抗氧化能力分析初报[J].中国蚕业,2010,31(3):17-19.

[4]陈忠敏,罗琴,张瑶琴,等.丝胶蛋白的细胞相容性和抗菌性能研究[J].丝绸,2012,49(11):1-5.

[5]侯国军,张金卫,李江涛,等.几种天然黄色茧品种蚕茧抑菌率的测定与比较[J].蚕桑茶叶通讯,2011(4):5-7.

[6]于国泳,郭鹏,孙登岳,等.超声辅助酶法制备山杏仁多肽[J].山东农业大学学报:自然科学版,2014,45(3):377-381.

[7]刘振春,韩宇,孙慧娟.超声波辅助酶法制备绿ACE 抑制肽的工艺研究[J].西北农林科技大学学报:自然科学版,2014,42(8):125-131.

[8]邓一民,段宣任,张高军.生丝用酒石酸脱胶的工艺条件优化试验[J].蚕业科学,2010,36(5):866-869.

[9]张雨青.蚕丝脱胶方法的比较分析[J].蚕业科学,2002,28(1):75-79.

[10]王英健.几种脱胶方法的比较研究[J].安徽农业科学,2008,36(33):14623-14624.

[11]Deng Yun, Yang Guiyun, Yue Jin, et al. Influences of ripening stages and extracting solvents on the polyphenolic compounds, antimicrobial and antioxidant activities of blueberry leaf extracts [J]. Food Control，2014,38:184-191.

[12]高慧颖,王琦,陈源,等.茂谷橘橙中类胡萝卜素含量的研究[J].福建农业学报,2010,25(2):197-200.

[13]王艳,张彦丽.分光光度法测定新疆昆仑雪菊中总黄酮的含量[J].新疆医科大学学报,2011,34(8):817-819.

[14]韩扬,何聪芬,董银卯,等.响应面法优化超声波辅助酶法制备燕麦ACE抑制肽的工艺研究[J].食品科学,2009,30(22):44-49.

[15]邓一民,张高军,敬凌霄,等.蚕丝木瓜蛋白酶脱胶工艺条件探讨[J].丝绸,2009(8):20-22.

[16]刘晓飞,刘宁,张娜,等.超声波辅助酶法提取甜玉米穗轴黄酮及抑菌性检测[J].食品科学,2014(20):79-82.

[17]马娇,陶海腾,徐同成,等.响应面法优化超声波辅助水酶法提取小麦胚芽油的研究[J].中国粮油学报,2013,28(12):57-62.

[18]姚东瑞,周鸣谦,刘云鹤,等.响应面法优化酶法提取泥鳅鱼油的研究[J].中国粮油学报,2012,27(6):66-70.

[19]王振伟,申森.超声波辅助酶法制备壳寡糖及抗氧化活性研究[J].中国食品添加剂,2014(4):70-75.

Process Optimization of Ultrasonic-assisted Enzymatic Degumming of Yellow Cocoons by Response Surface Methodology

Shao Shuangshuang1, He Liang2,Wei Chaoyang1,Li Weiqi1*

(1.College of Life Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058;2.Institute or Biological Technology, Zhejiang Forestry Academy, Hangzhou 310023)

The purpose of this research is to study the process of ultrasonic-assisted enzymatic degumming of yellow cocoons. Based on the single factor tests, the three factors: pH (X1), enzyme amount (X2), and the ratio of material to solvent (X3) had a significant impact on degumming rate of natural yellow cocoons. Then the three factors were assessed by response surface methodology (RSM) involving a three factors and three levels. The optimal process was determined as follows: the pH was 5.5, the enzyme amount was 5.5% (E/S), the ultrasonic power was 390 W , the ultrasonic treatment time was 35 min, the temperature was 60℃, and the ratio of material to solvent was 1∶30(m/v). Under such conditions, the ultrasonic-assisted enzymatic has higher degumming rate of 37.62%±0.34%, and the sericin protein after ultrasonic-assisted enzymatic degumming has higher DPPH scavenging activity (IC502.41±0.078mg/mL), content of carotenoids (0.34±0.038mg/g), and flavonoids (0.59±0.062mg/g) than boiling water bath and enzymatic degumming. The ultrasonic-assisted enzymatic degumming was further demonstrated superior.

Yellow cocoons; Degumming; Ultrasonic; Enzyme; Response surface methodology

2015-05-26

浙江省科技攻关计划(2014C32085)；浙江省科技攻关计划(2013GZ09)

邵双双(1990-)，女，硕士在读，研究方向：微生物学；*通讯作者：李卫旗(1964-)，男，博士，副教授，研究方向：微生物发酵,E-mail:kite006@163.com。

TS202.3

A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2015.04.001