庆大霉素生物合成基因genB4的研究

温淑平，　林强，　洪文荣

( 福州大学 生物科学与工程学院, 福建 福州 350116 )



庆大霉素生物合成基因genB4的研究

温淑平，林强，洪文荣*

( 福州大学 生物科学与工程学院, 福建 福州 350116 )

摘要：以庆大霉素生物合成基因簇为模版，构建了genB4基因阻断质粒pGB403.经接合转移导入绛红色小单孢菌G1008，得到一株genB4基因缺失工程菌GB4408.对菌株GB4408的发酵产物进行了TLC、HPLC和MS分析，结果表明GB4408不再合成庆大霉素C族组分，而是积累中间代谢产物G418、西索霉素和威大霉素，阻断了从西索霉素到庆大霉素C1a的转化以及从威大霉素到庆大霉素C2的转化，这可能是genB4基因参与了庆大霉素绛红糖胺C4′和C5′的双脱氢作用.据此推论，在菌株GbK(△genK)基础上敲除了genB4基因，并成功获得一株主产西索霉素的工程菌GbKB4，进一步验证了genB4的功能. 绛红色小单孢菌；genB4； 西索霉素 Q93

文献标识码：A

庆大霉素是由小单孢菌发酵液中分离得到的一组广谱抗生素，包含庆大霉素C1、C1a和C2等组分.在化学结构上，庆大霉素由2-脱氧链霉胺(2-DOS)、绛红糖胺和加洛糖胺3部分组成.研究[1-3]发现，庆大霉素的生物合成是从X2开始，分为2条路线(图1)：一条经JI-20A、西索霉素合成庆大霉素C1a；另一条经G418、JI-20B、威大霉素合成庆大霉素C2，并最终合成庆大霉素C1.2条合成路线的酶促反应只对绛红糖胺进行修饰.近年来，不同菌株的庆大霉素生物合成基因簇陆续被公布出来.F.Kudo等[1]通过与妥布霉素、卡那霉素生物合成基因簇比较，推测genB4为B型的氨基转移酶基因.Guo J.H.等[4]通过基因失活研究，推测基因genB4与绛红糖胺C3′,4′-双脱羟基有关.本实验组[5]也对genB4基因进行了失活，结果产生了带有新化合物的复杂组分的产物，但是否由genB4单基因失活而导致这一结果仍有待进一步验证；因此，有必要重新对genB4基因进行敲除.

本文通过基因框内敲除方法，重新设计引物，构建同源重组质粒，阻断绛红小单孢菌G1008中genB4(1 338 bp)的表达，并借助分析代谢物的变化，进一步研究genB4基因在庆大霉素生物合成过程中所起到的作用.

图1　庆大霉素生物合成途径

1材料与方法

1.1　材料

1) 质粒与菌株.克隆载体使用pMD19-T(日本TaKaRa)，用温敏型自杀质粒pKC1139[6]作为大肠杆菌-链霉菌属间穿梭载体.用E.coliTop10

作为质粒克隆宿主菌，用短小芽孢杆菌〔CMCC(B) 63202〕作为抗生素微生物检定菌，用E.coliET12567(pUZ8002)[7]作为大肠杆菌—链霉菌属间接合转移供体菌，用绛红色小单孢菌G1008和GbK(△genK)作为接合转移受体菌.

2) 培养基与抗生素.绛红色小单孢菌斜面培养基、种子培养基、发酵培养基以及孢子预萌发培养基参照文献[8].抗生素微生物检定培养基Ⅰ参照2010版《中华人民共和国药典》，大肠杆菌培养使用LB培养基，各培养基根据需要添加相应的抗生素.本研究使用的抗生素作用浓度分别为：氨苄青霉素100 μg/mL，安普霉素50 μg/mL，氯霉素25 μg/mL，卡那霉素25 μg/mL，萘啶酮酸25 μg/mL.

3) 工具酶与试剂.限制性核酸内切酶、T4 DNA Ligase、Taq DNA聚合酶、DNA Marker和Proteinase K(日本TaKaRa公司)；DNA凝胶回收试剂盒、RNase A酶和溶菌酶(上海生工生物工程有限公司)；其他常规试剂见参考文献[9].

1.2　方法

1)引物设计.以基因库(Genebank)公布的庆大霉素生物合成基因簇(登录号：JQ975418)为模板，利用生物信息学软件Vector NTI11.5设计两对引物扩增genB4基因上下游序列作为同源交换臂：引物P1/P2用于扩增上游交换臂B41，引物P3/P4用于扩增下游交换臂B42.设计引物P5/P6用于genB4基因阻断突变株的验证.所有引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物位置与扩增片段长度如图3所示，引物序列及其限制性酶切位点见表1.

2) DNA分子操作.PCR、质粒DNA抽提、大肠杆菌感受态细胞的制备、酶切、酶连和转化等常规分子克隆操作参照文献[10].绛红色小单孢菌基因组DNA的提取和接合转移参照文献[11].

表1　研究genB4所用引物

3)工程菌发酵及产物提取分析.绛红色小单孢菌发酵及产物提取方法参照文献[8]，生物效价测定参照2010版《中华人民共和国药典》.提取的产品采用硅胶GF254薄层层析(TLC)和HPLC进行初步检测，TLC展开剂为氯仿-甲醇-氨水(1∶1∶1，体积比),混合均匀后静置5 min，展开；HPLC参照2010版《中华人民共和国药典》,组分的精确测定采用质谱法.

2结果与讨论

2.1　重组质粒pGB403的构建

提取绛红色小单孢菌G1008基因组DNA，并以其为模板，PCR扩增genB4上下游交换臂B41和B42.将这两条交换臂分别克隆至pMD19-T载体，得到中间质粒pGB401和pGB402.质粒pGB401用Hind Ⅲ和EcoRⅠ酶切，回收1 963 bp片段；质粒pGB402用Hind Ⅲ和XbaⅠ酶切，回收2 019 bp片段；pKC1139用XbaⅠ和EcoRⅠ酶切，回收6 446 bp片段.将以上3个片段酶连，酶连样转化Top10感受态细胞，筛选阳性克隆子，最终获得重组质粒pGB403.用EcoRⅠ和XbaⅠ对pGB403进行酶切，酶切样经电泳检测(图2)有两条带与理论值(6 446 bp和3 994 bp)相符，最后通过测序验证，证明质粒pGB403为正确质粒.

2.2　GB4408菌株的构建

将重组质粒pGB403转化E.coliET12567(pUZ8002)得到接合转移供体菌E.coliET12567(pGB403/pUZ8002)，绛红色小单孢菌G1008的孢子作为接合转移受体菌.按照接合转移方法，将孢子悬液与供体菌混合，稀释涂布于平板培养基，于37 ℃培养约20 h后，再用含安普霉素和萘啶酸的水溶液覆盖，继续培养直至在平板上长出接合子.

图2　质粒pGB403酶切电泳检测图(1:PGB403,XbaⅠ/EcoRⅠ; 2:DL 5 000 Marker)

选取一株长势较好的接合子，提取基因组DNA，用P5/P6引物进行PCR扩增验证.如果得到两条片段，分别为1 241 bp和512 bp，那么说明其为单交换工程菌.PCR产物电泳结果与预期相符(图3B)，这表明重组质粒pGB403已成功整合到绛红色小单孢菌G1008，即单交换突变株菌，将其命名为小单孢菌GB41.

由于单交换菌株具有同源性极高的片段，不稳定，容易发生2次同源重组，获得genB4基因缺失双交换菌株或回复突变菌株，质粒pGB403与G1008同源重组示意图如图3A所示.

1:DL 5 000 Marker; 2:G1008(P5/P6); 3:GB41(P5/P6); 4:GB4408(P5/P6)图3　GB4408基因组DNA PCR产物电泳图

将单交换菌株GB41于37 ℃、不含抗生素的斜面上松弛培养3代，然后分离单菌落，通过单菌落影印点板方法进行筛选.经筛选，从408株菌株中获得2株在抗性平板上不生长，而在无药平板上正常生长的单菌落.为验证其是否为目的工程菌，选取其中一株长势良好的菌株，提取其基因组DNA，然后利用双交换鉴定引物P5/P6进行PCR验证.如果电泳只检测到512 bp的片段，而未检测到1 241 bp的片段，那么该菌株即为双交换工程菌.电泳检测结果表明所挑选的菌株为双交换工程菌，将其命名为GB4408，如图3所示.将PCR产物测序后，其结果进一步说明GB4408工程菌缺失了genB4基因729 bp.

2.3　GB4408菌株的代谢产物分析

GB4408的发酵液经树脂吸附、乙醇沉淀等处理之后，获得粗制样品.将样品进行TLC分析，结果如图4.图中主要有3个斑点，与标准品相比，未合成庆大霉素C1、C1a、C2等庆大霉素C族组分，转而合成其他庆大霉素中间体.

TLC：1 G1008, 2 GB4408图4　GB4408菌株代谢产物的TLC和HPLC分析

按照《中华人民共和国药典》[12]，对GB4408代谢产物进行HPLC分析，检测结果见图4.庆大霉素标准品各组分的保留时间分别为：C1(5.98 min)，C1a(14.58 min)，C2a(18.57 min)，C2(21.05 min).GB4408的粗制样品中的3个主峰，保留时间分别为7.68、18.72、20.12 min，这与庆大霉素标准品的保留时间无一相符.由此进一步表明GB4408的代谢产物没有庆大霉素C族组分.

为精确确定GB4408代谢产物的组分，采用MS分析，结果如图5所示.图中主要离子峰有4个，分别为448.3(西索霉素)、462.3(威大霉素)、476.3(威大霉素C6′位甲基化产物)、497.3(G418).231.6和249.1分别为威大霉素和G418的双电荷峰，322.2为碎片峰.这说明工程菌GB4408不再合成庆大霉素C族组分，而是积累中间代谢产物G418、西索霉素和威大霉素，阻断了西索霉素到庆大霉素C1a和威大霉素到庆大霉素C2的转化，据此推测genB4参与庆大霉素绛红糖胺C4′和C5′的双脱氢作用.

图5　GB4408菌株代谢产物的MS分析

2.4　GbKB4工程菌的构建

绛红小单孢菌GbK菌高产庆大霉素C1a，且genK基因失活，阻断了从庆大霉素X2至G418的转化.根据对genB4基因功能的推测，若在菌株GbK上继续敲除genB4基因，则有望获得西索霉素的工程菌.

利用上述方法，将供体菌ET12567/(pGB403/ pUZ8002)与GbK(△genK)的孢子进行接合转移，7 d后长出2株接合子，挑取长势良好的一株(命名为GbKB4-1).将其转接至小单孢菌种子培养基，松弛培养4代后开始分离单菌落，并影印到含50 μ/mL安普霉素和不含抗生素的平板上，筛选后获得工程菌GbKB4，提取其基因组DNA，用引物P5/P6进行PCR验证，电泳检测见图6.

1: GB4408(P5/P6); 2: DL 5 000 Marker; 3: GbK(P5/P6)图6　GbKB4基因组DNA PCR产物电泳图

2.5　工程菌GbKB4发酵及代谢产物分析

按照同样的方法，对工程菌GbKB4进行发酵及代谢产物的提取，组分分析采用HPLC，见图7.以西索霉素标准品作对照，按照庆大霉素的流动相来分析，西索霉素标准品出峰的保留时间为18.64 min.GbKB4粗制样品有2个主峰，保留时间分别为6.21 min和18.63 min.其中后者与标准品的出峰时间大致相符，由此初步确认其为西索霉素.

图7　GbKB4菌株代谢产物的HPLC分析

精确组分分析采用质谱检测，如图8所示.GbKB4工程菌离子峰448[M+H]+、470[M+Na]+、486[M+K]+，它们与西索霉素分子量同质.离子峰483[M+H]+，它与中间代谢产物庆大霉素X2同质.242[M+H]+为庆大霉素X2双电荷峰，其他峰为碎片峰或杂质峰.这表明GbKB4菌株中敲除genB4基因，阻断了西索霉素转化庆大霉素C1a，由此获得了一株主产西索霉素工程菌，同时也验证了genB4基因的功能.

图8　GbKB4菌株代谢产物的MS分析

3结论

本文在绛红色小单孢菌G1008中，对庆大霉素生物合成基因genB4进行框内敲除，获得工程菌GB4408.对其代谢产物分析，发现其不再合成庆大霉素C组分，而是积累中间代谢产物G418、西索霉素和威大霉素.genB4基因的失活，阻断了从西索霉素到庆大霉素C1a的转化以及从威大霉素到庆大霉素C2的转化，推测genB4基因参与了庆大霉素绛红糖胺C4′和C5′的双脱氢作用.由此推测，在genK基因阻断工程菌GbK的基础上敲除genB4基因后获得genK和genB4双基因失活的工程菌GbKB4.将GbKB4发酵后，提取其代谢产物，经HPLC和MS分析结果表明，工程菌GbKB4主要积累中间体西索霉素和庆大霉素X2.与工程菌GB4408相比，工程菌GbKB4不再合成G418和威大霉素，因此本文成功地构建了一株主产西索霉素的工程菌，同时也进一步验证了genB4基因的功能.

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Research ofgenB4 in gentamicin biosynthesis gene cluster

WEN Shuping,LIN Qiang,HONG Wenrong*

(CollegeofBiologicalScienceandTechnology,FuzhouUniversity,Fuzhou350116,China)

Abstract：A recombinant plasmid pGB403 was constructed with gentamicin biosynthesis gene cluster as the template to study the function ofgenB4. Then, the plasmid pGB403 was transformed intoMicromonosporapurpureaG1008 by conjugation. A disruptgenB4 was obtained, i.e.,emqineeringstrain(GB4408). Its ferment extract was analysised by TLC, HPLC and MS. The GB4408 mainly produced accumulated intermediate G418, sisomicin and verdamycin instead of gentamicin C compounds. The metabolic flux from sisomicin to gentamicin C1a and from verdamycin to getamicin C2 were blocked. This result indicated thatgenB4 might be responsible for the dehydrogenation at C4′- C5′of purpurosamine. Based on the speculation,genB4 was distrupted in the strain GbK(△genK), and the strain GbKB4 mainly produced sisomicin was successful constructed, which further verified the function ofgenB4.

Key words：Micromonosporapurpurea;genB4; sisomicin

文章编号：1004-4353(2015)04-0313-05

基金项目：国家自然科学基金资助项目(31070093)；国家“重大新药创制”科技重大专项项目(2012ZX09201101-008)

收稿日期：2015-09-23*通信作者： 洪文荣(1956—)，男，博士，教授，研究方向为微生物制药.