大蒜鳞茎浸提液对花生根腐病菌的抑制作用

袁冬梅，于静，迟玉成，许曼琳，张霞，郭志青，宋新颖，何康，李莹

（1.青岛农业大学理学与信息科学学院，山东 青岛 266109；2.山东省花生研究所，山东 青岛 266100）

花生（Arachis hypogaea）是我国重要的油料与经济作物。花生根腐病是一种常发性病害，其病原菌主要有尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum）、层出镰孢菌（F.proliferatum）和茄腐镰孢菌（F.solani）［1］。病原菌在花生整个生育期均可侵染，破坏维管束组织，影响正常的营养和水分等物质运输。该病害发生严重时造成减产20%以上。现阶段花生上镰孢菌的防治主要依赖化学药剂，存在易产生抗药性及环境污染等问题。为寻求绿色环保且高效广谱的防治措施，植物源杀菌剂的开发与研究日趋受到重视，利用其防治花生根腐病可减少农药残留，提高花生质量安全。

植物是生物活性化合物的天然宝库，含有的次生代谢产物包括生物碱类、萜烯类、黄酮类、柠檬素和番荔枝内酯等化合物都具有较强的抑菌活性［2，3］。利用植物提取物为材料探究其对病原菌的抑制作用是植物源农药研究的热点。丁香［4］、甘草［5］和瑞香狼毒［6］的提取物对植物枯萎病菌的抑制效果较好；Rongai等［7］发现石榴中的石榴鞣花酸可以抑制番茄枯萎病菌。

目前关于葱属植物浸提液对植物根腐病菌抑菌效果的研究已有不少报道。张伟等［8］研究表明葱属植物（洋葱、韭菜、葱、大蒜）的浸提液对三七根腐病病原菌均能产生显著的抑制效果，其中大蒜浸提液的效果最好。蒋继志等［9］采用4种葱属植物的水提液对引起草莓根腐病的两种主要病原菌进行抑菌效果研究，结果表明，韭菜和大蒜水提液在浓度较高时对胶孢炭疽菌和立枯丝核菌均有明显的抑制效果。大蒜（Allium sativmL.）是公认的天然植物广谱抗菌材料，大蒜油中含有29种含硫化学物质，对3个念珠菌专化小种和3个芽孢杆菌专化小种都具有抑制活性［10］；大蒜挥发性物质和大蒜浸出液的体外试验表明，其对多种人类致病真菌包括白色念珠菌有抑制和杀灭作用［11］。农业生产领域已有关于大蒜提取物控制农产品病害的研究报道。但是，关于大蒜对花生中病原菌的抑制作用及其防病效果研究不多。本研究通过测定大蒜鳞茎浸提液对花生根腐病菌的抑制作用，以期为利用大蒜植物源杀菌剂防治花生根腐病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum）PRIFo01、层出镰孢菌（F.proliferatum）PRI－Fp01和茄腐镰孢菌（F.solani）PRI－Fs01，分离自花生根腐病，由本实验室保存。新鲜紫皮大蒜购自山东省青岛市李沧农贸市场。

1.2 试验方法

1.2.1 大蒜鳞茎浸提液的制备 称取新鲜大蒜鳞茎40 g，洗净后切碎，浸泡在100 mL无菌水中，室温放置48 h。纱布过滤后再用0.2μm细菌过滤器过滤，获得大蒜鳞茎浸提液母液（0.40 g／mL），4℃保存。

1.2.2 大蒜鳞茎浸提液对3种镰孢菌的抑制作用 采用含药培养基法：将母液按照20%、10%、5%的体积比分别加入已融化并冷却至50℃左右的PDA培养基中，充分混匀后倒入培养皿中，制成分别含0.08、0.04、0.02 g／mL大蒜鳞茎浸提液的培养基，以不加浸提液为对照组（CK）。采用直径为6 mm的打孔器分别取新鲜活化5 d的镰孢菌菌饼接种到上述培养基中心，25℃培养，分别于5 d和10 d采用十字交叉法测量菌落直径，取平均值。每个浓度3个重复，试验重复3次。计算不同浓度大蒜鳞茎浸提液对花生根腐病3种镰孢菌菌丝生长的抑制率。

1.2.3 大蒜鳞茎浸提液对3种镰孢菌产孢量的影响 将母液按照20%、10%、5%的体积比分别加入PDB液体培养基中，采用直径为6 mm的打孔器每处理分别取新鲜活化5 d的镰孢菌菌饼2个，置于上述不同浓度的PDB（5 mL）中，25℃摇床培养3 d。滤布过滤掉菌丝后获得孢子悬浮液，稀释100倍后，采用血球计数板显微镜下统计分生孢子数，至少统计3次。以不加大蒜浸提液的PDB为对照，每个浓度设置3管，试验重复3次。1.2.4 大蒜鳞茎浸提液对3种镰孢菌孢子萌发的影响 按照1.2.3的方法获得非处理的孢子悬浮液。低转速离心后弃培养液，加入ddH2O重悬，再离心，重复3次，获得孢子悬浮液，孢子浓度稀释为105个／mL。将母液按照20%、10%、5%的体积比分别加入孢子悬浮液中，混匀后分别滴在玻片上，25℃静置4 h后，显微镜观察孢子萌发情况并计算孢子萌发率。每个浓度3个重复，试验重复3次。

1.2.5 大蒜鳞茎浸提液对花生根腐病的防治效果 选取培养10 d、大小一致的健康花生苗，每10株为一个处理，每种镰孢菌4个处理（0、0.02、0.04、0.08 g／mL大蒜鳞茎浸提液）。盆栽花生苗根部加孢子悬浮液5 mL（107个／mL）和布满菌丝的燕麦粒20粒，保湿培养24 h后，浇灌不同浓度大蒜鳞茎浸提液，20 d后统计结果。分级标准参照李迎宾等［12］：0级，健康，无症状；1级，腐烂仅发生在根表面，腐烂面积≤10%，或腐烂已扩展至内部且腐烂面积≤10%；2级，腐烂已扩展至内部且腐烂面积为10%～40%，支须根无腐烂；3级，腐烂已扩展至内部且腐烂面积为40%～50%，支须根腐烂；4级，腐烂已扩展至内部且腐烂面积为50%～70%，支须根腐烂脱落；5级，腐烂已扩展至内部且腐烂面积＞70%直至整个块根完全腐烂，支须根腐烂或整株萎蔫、倒伏或死亡。

1.3 数据统计与分析

采用Microsoft Excel进行数据统计，用Canvas软件和Microsoft office PowerPoint作图，并用新复极差法（Duncan’s法）进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 大蒜鳞茎浸提液对镰孢菌菌丝的抑制作用

由图1可知，大蒜鳞茎浸提液相同质量浓度时，尖孢镰孢菌和层出镰孢菌的菌丝生长更慢，受到的抑制作用更明显；同一镰孢菌的菌丝生长与大蒜鳞茎浸提液质量浓度成反比，浓度越高，菌丝生长的抑制作用越明显。生长5 d时，浸提液浓度0.08 g／mL，对尖孢镰孢菌菌丝生长的抑制率达98.31%，第10 d时抑制率为82.94%；在0.02 g／mL时，第5 d对层出镰孢菌的菌丝生长抑制率达到56.08%，第10 d时仍保持在50%以上；茄腐镰孢菌对大蒜鳞茎浸提液的敏感度相对较弱，即使在高浓度下抑制率也低于50%。表明大蒜鳞茎浸提液对3种镰孢菌菌丝生长均有抑制作用，层出镰孢菌对低浓度（0.02 g／mL）大蒜鳞茎浸提液敏感，尖孢镰孢菌对高浓度（0.08 g／mL）大蒜鳞茎浸提液敏感，而茄腐镰孢菌对大蒜鳞茎浸提液的敏感度相对较弱。

图1 大蒜鳞茎浸提液对镰孢菌菌丝生长的抑制作用

2.2 大蒜鳞茎浸提液对镰孢菌产孢量的影响

结果（表1）表明，3个浓度大蒜鳞茎浸提液对镰孢菌产生分生孢子数量具有显著影响，产孢量随大蒜鳞茎浸提液浓度的提高而减少，但3个浓度之间差异不显著。在低浓度（0.02 g／mL）条件下，层出镰孢菌产孢量减少94.25%，茄腐镰孢菌产孢量减少72.35%，尖孢镰孢菌产孢量减少64.77%。

表1 大蒜鳞茎浸提液对镰孢菌产孢量的影响

2.3 大蒜鳞茎浸提液对镰孢菌孢子萌发的抑制作用

由表2可知，随着大蒜鳞茎浸提液质量浓度的提高，镰孢菌孢子萌发率逐渐降低。低浓度（0.02 g／mL）即对尖孢镰孢菌表现出明显的抑制作用，对层出镰孢菌的抑制作用相对弱些；不同浓度对茄腐镰孢菌孢子萌发的抑制作用差异显著。大蒜鳞茎浸提液对镰孢菌孢子萌发的抑制效果表现为尖孢镰孢菌＞茄腐镰孢菌＞层出镰孢菌。

表2 大蒜鳞茎浸提液对镰孢菌孢子萌发率的影响

2.4 大蒜鳞茎浸提液对花生根腐病的防病效果

结果（图2）表明，随着大蒜鳞茎浸提液质量浓度的增加，对花生根腐病的防病效果增强，病情指数下降。但不同镰孢菌之间存在差异，对尖孢镰孢菌与层出镰孢菌的防病效果在0～0.04 g／mL范围内缓慢增加，0.04～0.08 g／mL范围内显著增强，0.08 g／mL时防病效果大于50%；对茄腐镰孢菌的防治效果不明显，与室内的抑菌试验结果一致。

图2 大蒜鳞茎浸提液对花生根腐病的防治效果

3 讨论与结论

本试验通过室内研究发现，大蒜鳞茎浸提液对花生根腐病3种镰孢菌的菌丝生长、产孢量和萌发均有不同程度的抑制作用。大蒜鳞茎浸提液对尖孢镰孢菌的菌丝生长和孢子萌发的抑制作用显著，对层出镰孢菌主要抑制其菌丝生长和孢子的产生，对茄腐镰孢菌的孢子产生及萌发有一定的抑制作用。室内盆栽花生根腐病的防病效果表明随着大蒜鳞茎浸提液浓度增加防病效果增强。

大蒜素是从大蒜中提取的植物源抗生素，具有抑制植物病原细菌和真菌的特性［13］。王继强等［14］对大蒜素的作用机理进行了研究，显示大蒜素并不是天然存在于鳞茎中，而是当其受到机械破碎后，大蒜素的前体蒜酶被激活，催化分解蒜氨酸，生成具有挥发性的大蒜素。祁高展等［15］研究表明，大蒜鳞茎浸提液主要活性成分有二烯丙基二硫化物（DADS）、二烯丙基三硫化物（DATS）、二甲基二硫醚（DMDS）、苯甲酸乙酯（ELB）、邻苯二甲酸二丁酯（DBP）和二烯丙基一硫化物（DAS）。无论是大蒜素还是大蒜鳞茎浸提液，发挥抑菌活性的作用机理可能是通过氧化巯基，使与微生物生长繁殖相关的含硫巯基的酶失活，抑制乙酰辅酶A，从而影响微生物生长繁殖，起到抑制或杀死病原菌的作用［13，16，17］。

花生根腐病镰孢菌通过菌丝和孢子侵染花生。大蒜鳞茎浸提液可以有效抑制菌丝的生长、减少孢子的产生以及抑制孢子的萌发，从而实现对花生根腐病的防治。虽然室内盆栽防病试验对茄腐镰孢菌的防治效果不明显，但是茄腐镰孢菌的致病力相对较弱，不是优势病原菌，对花生的危害作用小。本试验表明，大蒜鳞茎浸提液对3种镰孢菌的防治效果较明显，高浓度下能够显著抑制优势菌群，减少根腐病病情指数。植物源农药具有生态友好、可生物降解和目标特异性等特点［18，19］，为病虫害的绿色防控提供了新思路。大蒜来源广泛，价格低廉，便于贮藏。本研究结论可为大蒜与花生轮作或种植花生前将大蒜鳞茎粉碎后耕入田地用于花生根腐病的预防以及浇灌大蒜鳞茎浸提液防治花生根腐病等无公害、简易防病技术奠定了基础。