新疆瓜尔豆细菌性疫病病原鉴定

金恭玺，刘 林，任毓忠，杨江平，王 磊，王华兵

(1 石河子大学 农学院，新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用自治区高校重点实验室，新疆 石河子 832003；2 克拉玛依绿成农业开发有限责任公司， 新疆 克拉玛依 834000)

新疆瓜尔豆细菌性疫病病原鉴定

金恭玺1，刘 林2，任毓忠1，杨江平2，王 磊2，王华兵2

(1 石河子大学 农学院，新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用自治区高校重点实验室，新疆 石河子 832003；2 克拉玛依绿成农业开发有限责任公司， 新疆 克拉玛依 834000)

【目的】 明确新疆克拉玛依种植的瓜尔豆(CyamopsistetragonolobaL.)新爆发的细菌性病害的病原，以防止该病害在新疆瓜尔豆上进一步扩散和蔓延，保证该地区瓜尔豆产业的可持续发展。【方法】 从新疆瓜尔豆产区采集发病叶片、茎干及豆荚等组织进行病菌分离，对分离后的菌株采用喷雾法和针刺法进行致病性测定，并根据采集地点、田间发病症状和发病组织的不同，选取9个代表菌株观测其培养特性和生理生化特征；同时选取3个代表菌株进行16S rDNA测序。【结果】 该病害在整个瓜尔豆生长季均可以发生，危害叶片、茎干、叶柄、荚柄、豆荚和种子，造成叶枯、落叶、茎干爆裂、顶枯、豆荚和种子不能成熟或变黑坏死。从发病植株上共获得21个具有致病性的细菌菌株，菌株的致病性表现与田间症状基本一致。9个代表性菌株在YEPG培养基上培养72 h后形成淡黄色奶油状的圆形菌落，在KB培养基上无黄绿色荧光反应；均为革兰氏阴性、杆状、严格的好氧型细菌；烟草过敏性坏死反应均为阳性；接触酶阳性，氧化酶阴性，耐盐性表现为耐20～30 g/L NaCl。选取的3个代表菌株的16S rDNA 序列与Xanthomonasaxonopodis菌株XV 938的同源性达99.95%。【结论】 将引起该病害的病原确定为地毯草黄单胞菌瓜尔豆致病变种(Xanthomonasaxonopodispv.cyamopsidis)，该病害确定为瓜尔豆细菌性疫病。

瓜尔豆；细菌性疫病；病原鉴定；地毯草黄单胞菌瓜尔豆致病变种

瓜尔豆(Cyamopsistetragonoloba)又叫簇生豆，属于豆科瓜尔豆属。瓜尔豆种子含蛋白质及少量脂肪，营养丰富，可食用；植株可作饲料及绿肥。瓜尔豆种子胚乳中含有大量瓜尔胶，瓜尔胶主要用于石油开采业，用其配制成水基压裂液，能增加含油地层的渗透性，对提高石油产量有显著效果。此外，瓜尔胶也广泛应用在造纸、纺织、食品、香料、药物及冶矿工业上[1]。

瓜尔豆原产于印巴次大陆西部，在世界各地已有数百年的栽培历史。从20世纪70年代开始,我国各地相继引种并较大面积推广种植瓜尔豆，主要的种植区有云南、广西、新疆和海南。新疆因拥有克拉玛依、吐哈、塔里木等多个油田,每年水基压裂需要大量的瓜尔胶，且该地区地理气候条件与印巴次大陆瓜尔豆产地的自然条件相近，同时克拉玛依市建有一年产500 t瓜尔胶的生产厂，这些条件促进了瓜尔豆在新疆的大面积种植。2000年以后，瓜尔豆在新疆的克拉玛依、阿勒泰、石河子地区以及南疆喀什地区的莎车县等都有大量种植[2]。

2013年5-8月，新疆克拉玛依种植的瓜尔豆上出现了一种未曾见过的病害，其症状表现为叶片上出现淡褐色至褐色坏死斑，茎干、叶柄及豆荚果柄上呈现黑色条形坏死斑，并引起茎干爆裂及植株萎蔫死亡，豆荚变褐，种子干瘪不能成熟或成熟种子变黑。07-20调查发现，该病害田间平均发病率达50%，严重者发病率达80%甚至更高，田间死亡率20%左右，严重影响当地瓜尔豆的产量和瓜尔胶的品质。为了防止该病害在新疆瓜尔豆上的进一步扩展和蔓延，保证新疆瓜尔豆产业的可持续发展，本试验从病区采集发病的叶片、茎干、果柄、种子及豆荚进行病原菌分离，并对分离到的菌株进行培养特征观察、生理生化特性测定及16S rDNA测序，以对这种新的病害进行全面研究，为该病害的进一步防治奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 病原菌的分离

分离所用培养基为金氏B(King’s B，KB)培养基。将自新疆克拉玛依田间采集的瓜尔豆发病叶片、茎干、果柄、豆荚及种子用体积分数70%的酒精表面消毒30 s,无菌水冲洗3次，用灭菌刀切取大小为0.5 cm×0.5 cm的小块置于加有500 μL灭菌水的小研钵中研磨,蘸取研磨液在KB培养基上划线分离，28 ℃培养72 h 后，挑取单菌落进行纯化。

1.2 致病性测定

致病性测定选用的植物材料为当地种植的瓜尔豆。将瓜尔豆种子播种于灭菌土中，每培养钵种植6粒，待植株长出2～3片真叶后接种。将纯化后的菌株分别在KB培养基平板上28 ℃培养72 h后,用无菌水配成1×108CFU/mL的细菌悬浮液。采用针刺法和喷雾法接种：针刺法采用4.5号规格大小的无菌针头蘸取菌液，轻刺瓜尔豆幼苗第1片真叶上部茎干,每株刺伤1次，以无菌水针刺作为对照；喷雾法接种是将菌液喷洒于瓜尔豆全株，以叶片正反两面刚好喷湿为准，以无菌水接种作为对照。接种后，在25～30 ℃条件下保湿48 h，每处理接种1个培养钵植株。2次重复。

1.3 病原菌鉴定

1.3.1 培养性状观察 将供试菌株在KB和YEPG(葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母浸汁10 g，琼脂粉15 g，蒸馏水1 000 mL)培养基上培养72 h后，观察菌落形态、大小及颜色。

1.3.2 烟草过敏反应 按《植物病原细菌的分类和鉴定》[3]中的方法进行。

1.3.3 生理生化特征测定 选取具有致病性的来自不同地块、田间症状表现不同、发病组织不同的9个菌株(编号分别为Xac-1、Xac-4、Xac-6、Xac-8、Xac-10、Xac-12、Xac-16、Xac-18和Xac-20)作为供试菌，对选取的9个代表性菌株进行生理生化测定,具体参照文献[3-4]中的方法进行。

1.3.4 16S rDNA测序 分别选取从叶片、茎干及种子上分离的Xac-1、Xac-12和Xac-20菌株，按文献[5]的方法提取基因组DNA。利用16S rDNA的通用引物Sr1:5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′和Sr2:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′进行PCR扩增[6]。产物送北京华大基因公司测序。测序结果利用http://www.ncbi.nlm.nih.gov网站中的BLAST进行序列比对及同源性分析，以确定该病原的归属。

2 结果与分析

2.1 瓜尔豆病害的田间症状

瓜尔豆病害田间症状从其出苗到豆荚成熟都会发生(图1-A，B，C)。发病初期瓜尔豆叶片、茎干、荚柄、豆荚上形成小的水渍状斑点，随着病情的发展，叶片上形成小的近圆形褐色坏死斑，病斑直径3～5 mm，呈透明状;但叶片发病症状大多表现为先叶尖褪绿，后沿叶缘形成大面积淡褐色坏死，该症状病斑不出现水渍状，也不透明，严重时导致整个叶片萎蔫死亡。茎干和荚柄发病先在侵染点形成水渍状深绿色条形病斑，病斑沿茎干扩展，形成黑色条形坏死，后发病部位茎干扭曲开裂，内部组织坏死，植株上部萎蔫死亡，顶部下垂，造成顶枯，严重时整株萎蔫死亡，严重影响植株的结荚和产量。豆荚和种子发病，症状多出现在豆荚靠近果梗和荚顶部的位置，感染部位初呈水渍状，后变为黑色坏死，沿豆荚向上部发展，在豆荚上形成黑色坏死斑，病斑形状不规则，剥开豆荚，发病部位组织呈水渍状、透明；内部种子变为黑色或黑褐色，感染早的种子干瘪不能成熟，感染较晚的种子虽可以成熟，但种子颜色变为黑色，严重影响瓜尔豆种子的品质。以上田间症状与已报道的瓜尔豆细菌性疫病的症状[7-8]完全一致。

2.2 瓜尔豆病原分离物的致病性

从瓜尔豆发病植株上分离纯化得到21个菌株，采用喷雾法和针刺法接种瓜尔豆幼苗后7 d均开始发病，喷雾法接种的幼苗症状表现为真叶上出现水渍状近圆形小病斑，后变为褐色坏死斑；叶缘和叶尖发病较晚，沿叶缘形成大的淡褐色坏死斑,茎干上部形成水渍状后变为黑褐色的条形斑。针刺法接种的幼苗症状表现为先在针刺部位形成水渍状条斑，随后扩展变为黑色或黑褐色长的条状坏死，直至感染部位的茎全部坏死，引起顶部凋萎下垂。不论是针刺法还是喷雾法接种，后期都可以造成整株黑色干枯死亡(图1-D)。所有21个供试菌株均能使所有接种幼苗发病，发病率100%，而对照(CK)都没有发病。这说明分离得到的21个菌株均具有很强的致病性，致病率为100%。

2.3 瓜尔豆病原菌的鉴定

2.3.1 培养性状观察 供试菌株在YEPG培养基上培养72 h后，形成淡黄色奶油状的圆形菌落，菌落直径2～4 mm，微凸起，边缘整齐；KB培养基上的菌落在紫外灯下观察无黄绿色荧光。

2.3.2 烟草过敏性反应 用卡介苗注射器将供试菌株的菌悬液注射入普通烟叶片的细胞间后，在24 h内，注射点周围产生明显的黄褐色过敏性坏死枯斑，而注射无菌水的对照无过敏性枯斑出现，表明所有供试菌株都能引起烟草的过敏性坏死反应。

2.3.3 生理生化特征 经测定,9个代表性菌株均为革兰氏阴性、杆状、严格的好氧型细菌；在KB培养基上无黄绿色荧光反应，烟草过敏性坏死反应均为阳性；接触酶阳性，氧化酶阴性，耐盐性表现为耐 20～30 g/L NaCl，能利用胱氨酸产生H2S，能水解淀粉和七叶苷，不能使明胶液化，能利用果糖和海藻糖作为碳源产酸，不能利用甘露糖、D-阿拉伯糖和纤维二糖(表1)。

注：+.阳性;-.阴性;+-.弱反应；O.好氧。

Note:+.Positive;-.Negative;+-.Light reaction;O.Aerobic.

2.3.4 16S rDNA克隆测序 将测得的Xac-1、Xac-12和Xac-20菌株的16S rDNA 序列(约 1 500 bp，Genbank登录号分别为KF563926、KF563927和KF563928 )与GenBank 中的核酸数据进行对比分析，结果表明，本研究测得的3个代表菌株的16S rDNA 序列与地毯草黄单胞菌(Xanthomonasaxonopodis)菌株XV 938的16S rDNA 序列 (GenBank登录号为AF123091)的同源性达99.95%，由此确定该病原与X.axonopodis有很近的亲缘关系。

根据供试菌株在YEPG培养基上的培养特征、生理生化特性及16S rDNA 序列比对结果，参照文献[3-4]，将该病原确定为地毯草黄单胞菌(Xantnomonasaxonopodis)，同时依据该病害在田间的症状表现及致病性测定结果，将该病原鉴定为地毯草黄单胞菌瓜尔豆致病变种(X.axonopodispv.cyamopsidis)。

3 结论与讨论

本研究通过病原菌形态特征观察、培养特性观察、生理生化特征测定及16S rDNA的序列测定和比对，明确了引起新疆克拉玛依瓜尔豆病害的分离物与地毯草黄单胞菌(Xantnomonasaxonopodis)的特征相一致，同时结合该病菌所引起的瓜尔豆田间病害症状与已报道的瓜尔豆细菌性疫病一致[9-12]，将该病害确定为瓜尔豆细菌性疫病；由于对黄单胞菌致病变种划分的主要依据是其引起的病害特征及寄主的专一性，因此将引起新疆瓜尔豆细菌性疫病的病原菌鉴定为地毯草黄单胞菌瓜尔豆致病变种(X.axonopodispv.cyamopsidis(又名:X.campestrispv.cyamopsidis(Patel et al.,1953))。

瓜尔豆细菌性疫病最早由Patel等[13]在印度的拉贾斯坦邦(Rajasthan)第一次发现并报道，并将该病害命名为细菌性叶斑病(Bacterial leaf spot)，随后又将其定为由X.axonopodispv.cyamopsidis引起的细菌性疫病[8]。随着瓜尔豆种植区域的不断扩大，该病害在印度的哈里亚纳邦(Haryana)和卡纳塔克邦(Karnataka)、美国的亚利桑那州(Arizona)和威斯康辛州(Wisconsin)以及巴西等世界各地相继被发现[7，9-12]。细菌性疫病是对瓜尔豆为害最严重、发生最普遍的病害之一，尤其是在雨季和灌溉较频繁的地区[14]。程美仁[15]对我国瓜尔豆细菌性病害——青枯病(X.cyamopsidis)在广东东山县的发生和危害程度以及田间症状作了简单描述，但对病原、发病规律及防治措施没有进行详尽的研究。细菌性疫病的远距离传播主要是通过带菌的种子，带菌种子是病害初侵染的主要来源。近年来，新疆大量从印度、巴基斯坦等国引进瓜尔豆种子，病原菌很可能通过疫区传入我国。通过对当地引进种子进行种植后的带菌检测，发现幼苗发病率达3.5%，说明种子带菌应是该病害在新疆发生和传播的主要来源。在田间幼苗可以隐症带菌，并主要通过风雨传播侵染健康植株，病害发生的严重程度与生长季节的降雨量关系密切。2013年5-8月新疆北疆地区降雨频繁，降雨量和降雨日明显多于往年30%～50%，为该病害的扩散提供了很好的环境条件。一旦环境条件适合病害的发生，可导致瓜尔豆减产68%以上[16]。因此，确定病害的种类和主要初侵染来源，并制定有效的防治措施，是保证瓜尔豆产业在新疆可持续发展的当务之急。

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Identification of pathogen of guar bacterial blight in Xinjiang

JIN Gong-xi1,LIU Lin2,REN Yu-zhong1,YANG Jiang-ping2, WANG Lei2,WANG Hua-bing2

(1KeyLaboratoryatUniversitiesofXinjiangUygurUtonomousRegionforOasisAgriculturalPestManagementandPlantProtectionResourceUnilization,CollegeofAgriculture,ShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang832003,China;2LvchengAgriculturalDevelopmentCo.Ltd,Karamay,Xinjiang834000,China)

【Objective】 This study identified the pathogen of guar bacterial blight,a new bacterial disease observed on field-grown guar (CyamopsistetragonolobaL.) in Karamay,Xinjiang.It could help to prevent its further spread and support sustainable guar production in Xinjiang.【Method】 Samples of diseased leaves,stems,petioles,pods,and seeds were collected and isolated.Pathogenicities of isolated bacterial strains were tested by spraying and puncturing methods.Then 9 strains were selected for determination of cultural characteristics and physiological and biochemical characteristics based on location,symptoms and infected tissues.At last,16S rDNA of three strains were amplified and sequenced.【Result】 Field symptoms included large angular necrotic lesions at leaf tips,black streaks on petioles and stems,cracking stems,defoliation,wilting or top-withering,vascular necrosis,and dieback.A total of 21 strains with pathogenicity were obtained and the pathogenicity was consistent with field symptoms.After 72 h culture of the selected 9 strains on YEPG medium,yellow-pigmented,opaque,and round colonies were isolated and no yellow-green fluorescence was observed.These strains were aerobic and gram-negative rods.They were positive for H2S,esculin,oxidase,and tobacco hypersensitivity,and their maximum salt tolerance was 20-30 g/L NaCl.The 16S rDNA sequences of the selected three strains shared 99.95% identity with Xanthomonas axonopodis strain XV 938.【Conclusion】 Based on morphology,pathogenicity tests,16S rDNA sequencing,and host plant specificity,the pathogen was confirmed asX.axonopodispv.cyamopsidis(synonym:X.campestrispv.cyamopsidis(Patel et al.,1953).

guar;bacterial blight;pathogen identification;Xanthomonasaxonopodispv.cyamopsidis

2013-11-14

新疆兵团科技创新团队计划项目“兵团农作物病害安全防控创新团队项目”(2013CC002)；国家自然科学基金项目(31160357)

金恭玺(1989-)，男，甘肃兰州人，硕士，主要从事病害流行学研究。E-mail:jingxwqz@163.com

任毓忠(1970-),男，新疆奇台人，副教授，主要从事植物细菌病害和病害流行学研究。E-mail:ryzh_agr@shzu.edu.cn

时间:2015-01-19 09:19

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.03.012

S41-32

A

1671-9387(2015)03-0141-05

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150119.0919.012.html