毛果杨HDAC基因家族序列及其表达分析

李淑娟，张 超，张彦妮，董亚茹，马旭俊

(东北林业大学 a 林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)，b 园林学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

毛果杨HDAC基因家族序列及其表达分析

李淑娟a，张 超a，张彦妮b，董亚茹b，马旭俊a

(东北林业大学 a 林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)，b 园林学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

【目的】 研究毛果杨组蛋白去乙酰化酶(HDAC)基因家族序列及其对脱落酸(ABA)的应答反应，为HDAC 家族基因的功能研究奠定基础。【方法】 采用生物信息学方法对毛果杨HDAC家族的16种蛋白进行系统分析；采用实时荧光定量 PCR方法，分析了100 μmol/L ABA叶面喷洒处理后6和24 h毛果杨叶片HDAC家族16个基因的表达情况。【结果】 HDAC家族蛋白分析显示，毛果杨HDAC可分为3个亚家族，即RPD3/HDA1、HD2和SIR2亚家族，与拟南芥HDAC蛋白的亲缘关系较近。HDAC家族大多数成员为亲水性蛋白质(HDA912属于疏水性蛋白)，其等电点呈酸性(除了HDA912和SIR2亚家族)。HDAC家族蛋白受磷酸化调节，磷酸化位点主要发生在丝氨酸残基上。绝大部分HDAC蛋白都有不同数目的跨膜螺旋和不同的跨膜方向，而在HD2蛋白中没有发现跨膜区。二级结构分析显示，RPD3/HDA1和SIR2亚家族成员均含有不同比例的α-螺旋、β-折叠片和无规则卷曲，其中无规则卷曲比例达到50%以上(HDA912除外)；而HD2亚家族成员不含有α-螺旋，其二级结构主要以无规则卷曲为主，比例高达80%左右。HDAC家族蛋白主要定位于细胞核内，在细胞质、细胞器及其他膜结构中也有分布， HD2蛋白几乎都定位于细胞核内。RPD3/HDA1和SIR2亚家族成员的三级结构可分为6种类型，预示其生物学功能也可能存在差异。实时荧光定量 PCR分析结果表明，ABA处理6 h显著提高了毛果杨HDA901、HDA903和HDT901基因的表达，而ABA处理24 h则会显著降低HDA907和HDT901基因的表达。【结论】 作为植物特有的一类组蛋白去乙酰化酶，毛果杨HD2亚家族蛋白在序列和结构等多个方面与其他2个亚家族不同。ABA能够调节杨树HDAC家族基因的表达，HDAC家族基因不同成员对ABA的应答反应不同。

毛果杨；组蛋白去乙酰化酶；生物信息学；脱落酸(ABA)；基因表达

表观遗传调控是植物适应环境胁迫的一个十分重要的调节机制。表观遗传调控是在不改变DNA序列的情况下，通过DNA或组蛋白修饰来调节基因的表达，具有快速、可逆和可遗传[1]的特点。最近研究表明，不同的环境胁迫均可导致组蛋白修饰的改变[2]。组蛋白翻译后修饰包括组蛋白乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化和甲基化等。其中，对组蛋白乙酰化研究得最早[3]且比较清楚，其在真核细胞转录活动调节中起着至关重要的作用。组蛋白乙酰化主要发生在组蛋白尾部的赖氨酸(Lysine)残基上，是一个可逆的动态平衡过程，由组蛋白乙酰基转移酶(Histone acetyltransferase，HAT)催化的组蛋白乙酰化和组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase，HDAC)催化的组蛋白去乙酰化共同调节。HAT可将乙酰基辅酶A上的乙酰基转移到组蛋白末端的赖氨酸残基上；而HDAC可将组蛋白末端的乙酰基去除。HAT介导的组蛋白乙酰化使染色质结构处于伸展状态，有利于转录因子的结合，因此一般被认为与基因的转录激活有关；而HDAC介导的组蛋白去乙酰化使染色质处于紧缩状态，不利于转录因子或转录调节因子与DNA结合，因此一般被认为与基因的抑制/沉默有关。由于HAT与基因转录激活有关，因此有关HAT的研究相对较多。后来发现，HDAC可与多种调节蛋白形成大的复合体来调节基因的转录[4-6]，使人们逐渐认识到基因的表达是由HAT和HDAC共同调节的，二者缺一不可，HDAC的研究也因此逐渐受到人们的重视。

HDAC在真核生物如酵母、真菌、动物、植物以及人类中广泛存在。很多研究表明，人HDAC与癌症的发生和发展有密切关系[7]。1988年首次在植物中发现HDAC的存在[8]。直到最近几年，植物HDAC的研究才开始受到重视，相关研究也逐渐增多，HDAC蛋白和基因在多种植物中得到克隆和鉴定。HDAC的功能研究主要集中在玉米[6,9-11]、拟南芥[10-14]、水稻[15-16]等草本植物上。虽然目前来自不同植物的众多HDAC基因的功能还有待研究，但已有的研究结果均表明，HDAC与基因沉默、植物生长发育和胁迫反应直接相关。

基于酵母HDAC序列的同源性分析可知，植物HDAC可分为3个亚家族：RPD3/HDA1、HD2 和SIR2[17]。RPD3/HDA1是HDAC家族最大的一个亚家族，所有的成员都含有一个典型的组蛋白去乙酰化酶结构域，其酶活性的发挥需要Zn2+的存在。RPD3/HDA1 类型的组蛋白去乙酰化酶主要分布于细胞核、细胞质或穿梭于细胞核与细胞质之间[18]，与植物的生长、发育以及生物和非生物胁迫有关。HD2蛋白在玉米胚中首次被发现[9,12]，与其他真核生物中已确定的HDAC没有序列相似性，在动物和酵母中均未发现，是植物自身特有的一类组蛋白去乙酰化酶。已有的研究表明，HD2蛋白主要定位于细胞核[18]，可能与核仁染色质区的结构和功能有关。拟南芥AtHD2C除与环境胁迫有关[19]外，还与生殖发育有关[20-21]。植物SIR2蛋白(又称Sirtuin)是与酵母SIR2同源的一类组蛋白去乙酰化酶，这类组蛋白去乙酰化酶与其他HDAC没有相似的结构，其酶活性的发挥依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的存在。RPD3/HDA1 类型的组蛋白去乙酰化酶和HD2蛋白均能被trichostatin A (TSA)或butynate所抑制，而SIR2蛋白的酶活性不能被这些抑制剂抑制，其酶活性可被烟酰胺(nicotinamide)、splitomicin、sirtinol等所抑制[22]。因此，SIR2 蛋白被看作是一类新型的组蛋白去乙酰化酶。SIR2蛋白与染色质沉默、细胞代谢和寿命有关[23]。人们对植物SIR2蛋白的功能了解甚少。最近发现，水稻OsSRTI具有保护基因组稳定和抗氧化胁迫的作用[15,24]。玉米有15个HDAC基因，编码10个RPD3/HDA1蛋白、4个HD2 蛋白和1个SIR2蛋白[6]。最近发现，玉米RPD3亚家族基因与细胞发育[25]和细胞周期有关[26]。水稻中存在18个HDAC基因，编码14个RPD3/HDA1蛋白、2个HD2 蛋白和2个SIR2蛋白[27]。水稻HDAC基因表达受环境胁迫的影响[15,28]，例如低温胁迫会抑制水稻HDA712、SRT701、SRT702的表达；甘露醇处理能够诱导HDT701的表达，抑制SRT701和SRT702的表达；NaCl处理能够诱导HDT701和HDA714的表达，降低SRT701和SRT702的表达[15]。拟南芥有18个HDAC基因， 编码12个RPD3/HDA1蛋白、4个HD2 蛋白和2个SIR2蛋白[27]。其中，对RPD3/HDA1亚家族的AtHDA19、AtHDA6和AtHDA18基因以及HD2亚家族的AtHD2C和AtHD2A基因的功能研究得比较清楚，其他家族成员的基因功能尚有待研究。AtHDA19与发育[29-30]和胁迫[31-33]相关，AtHDA19的反义抑制或T-DNA插入突变会导致植株出现多种表型上的改变，如早期衰老、叶片呈锯齿状、空中花环、花器官一致性上的缺陷和晚开花等[19]；此外，AtHDA19第2个外显子插入一段 T-DNA产生的突变体对脱落酸(ABA)和NaCl高敏感[31]；拟南芥AtHDA6与转座因子抑制[34-35]、基因沉默[36-37]和胁迫反应[31,38-39]相关；AtHDA18与根表皮细胞模式形成有关，TSA处理引起根毛细胞在非根毛形成部位出现和发育[40]；AtHD2C与环境胁迫有关，拟南芥AtHD2C的过量表达提高了转基因植株的耐盐性[41]；AtHD2A与生殖发育有关[20-21]。总体而言，目前只是对少数HDAC基因研究得相对深入，而对来自多种植物的众多HDAC基因的功能仍有待研究。

脱落酸是一种非常重要的植物激素，主要调节植物生长、发育以及对逆境胁迫(如渗透胁迫)的适应。一般情况下，非生物胁迫能够诱导ABA的积累，ABA通过调节染色体的重塑来调节胁迫基因的表达和胁迫耐受性，以及种子的成熟、休眠和发芽[42]。Chen等[38]研究发现，ABA能够诱导拟南芥H3K4三甲基化和ABA应答基因的表达，而这些作用都需要HDA6的存在。在HDA6突变体axe-5中，H3K4三甲基化水平降低，ABA应答基因(如ABI1、ABI2、 3KAT1、KAT2和RRD29B)的表达下降，种子发芽对ABA和盐胁迫敏感，发芽率下降。此外，拟南芥HDA19 T-DNA插入突变体hda19-1也对ABA和盐胁迫超敏感，其ABA应答基因ABI1、ABI2、3KAT1、KAT2和RRD29B的表达下降，种子发芽率也下降[31]。ABA还能够抑制拟南芥HD2C基因的表达，hd2c-1和 hd2c-3突变体对ABA和NaCl敏感[43]，而HD2C在拟南芥中的过量表达降低了植株对ABA的敏感性，降低了蒸腾速率，提高了植株对盐和干旱的耐受性[41]。这些研究表明，HDAC参与植物对ABA和胁迫的应答反应。

近年来，人们对HDAC的研究主要集中在草本植物上，而对木本植物HDAC基因的结构和功能了解甚少。本研究以毛果杨(PopulustrichocarpaTorr.& Gary)基因组信息为基础，对其HDAC家族成员的系统进化、理化性质、磷酸化位点、亲/疏水性、跨膜区、亚细胞定位、二级结构和三级结构进行了分析和预测；同时采用实时荧光定量PCR方法，对HDAC基因家族的表达与ABA的关系进行了分析，以期为HDAC基因的功能研究提供有用的参考信息和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

毛果杨无菌苗由林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)程玉祥教授馈赠。

从植物染色质因子数据库(http://www.chromdb.org)得到毛果杨HDAC家族16个成员的氨基酸序列。

1.2 毛果杨HDAC家族蛋白的生物信息学分析

利用生物信息学软件、数据库和互联网上的生物信息学程序，对毛果杨HDAC家族成员的一级结构和理化性质、跨膜域、二级结构、亚细胞定位和三级结构进行预测和分析；并且利用MEGA 5.0软件构建毛果杨与拟南芥HDAC的系统进化树，分析它们在进化上的关系。

1.2.1 毛果杨HDAC序列系统进化树的构建 HDAC家族功能研究最多的植物是拟南芥，拟南芥HDAC家族有18个成员，从植物染色质因子数据库得到拟南芥HDAC家族18个成员的氨基酸序列，利用Clustal W 对HDAC家族氨基酸序列进行多重比对，并利用生物学软件MEGA 5.0构建毛果杨和拟南芥HDAC家族成员系统进化树，采用遗传距离建树法的相邻连接法(Neighbor-Joining，NJ)建树，对生成的树进行1 000次的Bootstrap(自引导)校正。

1.2.2 毛果杨HDAC家族蛋白的一级结构和理化性质分析 利用ExPaSy提供的ProtParam在线程序(http://web.expasy.org/protparam/)，对HDAC家族蛋白一级结构进行预测分析；利用ExPaSy提供的ProtScale在线程序(http://expasy.org/tools/protscale.html)，对HDAC家族蛋白进行蛋白质亲/疏水性分析；利用NetPhos 2.0 在线分析程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)，对HDAC家族蛋白进行蛋白磷酸化位点分析。

1.2.3 毛果杨HDAC家族蛋白跨膜区域预测及二级结构 利用TMpred在线程序(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)，对HDAC家族蛋白的跨膜区域进行分析；利用PredictProtein在线程序(https://www.predictprotein.org/)，对HDAC家族蛋白的二级结构进行分析，包括对各个家族成员其蛋白α-螺旋(α-helix，H)、β-折叠(β-strand，E)和无规则卷曲(loop，L)进行预测。

1.2.4 毛果杨HDAC家族蛋白亚细胞定位及三级结构预测 利用WoLF PSORT在线软件(https://wolfpsort.org/)，对HDAC家族蛋白的亚细胞定位进行分析；利用SWISSMODEL同源建模服务器(http//swissmodel.expasy.org)，对HDAC家族蛋白的三级结构进行预测。

1.3 毛果杨HDAC家族基因的表达分析

采用实时荧光定量PCR方法，对ABA处理条件下HDAC家族16个基因的表达进行分析。

1.3.1 毛果杨无菌苗的ABA处理 毛果杨无菌苗培养1个月后，转移至装有蛭石的营养钵中，浇灌1/4 MS培养基，在植物培养室中培养。培养条件为22～25 ℃，光照/黑暗时间为16 h/8 h。培养1周后选取株高和生长状态一致的幼苗进行ABA处理，ABA浓度为100 μmol/L，采用叶片喷洒的方式处理 0，6和24 h，然后剪取叶片，经液氮速冻后保存于-80 ℃，用于叶片总RNA的提取。试验重复3次。

1.3.2 植物总RNA的提取和cDNA的合成 采用Trizol试剂提取毛果杨叶片总RNA，具体提取方法参见Trizol试剂盒使用说明书；采用PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa)试剂盒将所提取的总RNA反转录为cDNA；合成的cDNA稀释10倍后作为模板用于HDAC家族基因的实时荧光定量PCR分析。

1.3.3 毛果杨HDAC家族基因的实时荧光定量PCR分析 人工合成HDAC家族基因的特异引物(表1)，采用SYBR Premix ExTaqⅡ(TaKaRa)试剂盒进行实时荧光定量PCR，分析ABA对16个HDAC家族基因表达的影响。以毛果杨18S为内参，采用2-ΔΔCt的方法计算HDAC家族基因的表达水平。ABA处理前(0 h)HDAC基因家族每个成员的表达水平均指定为1；与处理0 h的表达水平相比，从而得出ABA处理6和24 h的表达水平(n倍)。采用t检验法比较ABA处理6和24 h mRNA表达量与处理前(0 h)的差异。P<0.05表示表达水平存在显著性差异。

2 结果与分析

2.1 毛果杨HDAC家族蛋白的系统进化分析

利用Clustal W程序对毛果杨(Pt)和拟南芥(At)HDAC家族蛋白进行氨基酸序列比对，并利用MEGA 5.0软件对比对结果进行系统进化树的构建，结果见图1。

图1表明，毛果杨和拟南芥HDAC家族蛋白可分为3个亚家族，即RPD3/HDA1、HD2和SIR2亚家族。3个亚家族的基因分别命名为HDA、HDT和SRT(http://www.chromdb.org)。毛果杨RPD3/HDA1亚家族有11个成员，包括HDA901、HDA902、HDA903、HDA904、HDA905、HDA906、HDA907、HDA908、HDA909、HDA910和HDA912；HD2亚家族有3个成员，包括HDT901、HDT902和HDT903；SIR2亚家族有2个成员，包括SRT901和SRT902。系统进化树显示，毛果杨与拟南芥HDAC家族在进化关系上比较近，有很高的同源性。

2.2 毛果杨HDAC家族蛋白一级结构与理化性质

2.2.1 理化性质 利用ProtParam在线程序(http://web.expasy.org/protparam/)对毛果杨HDAC家族蛋白进行一级结构与理化性质分析，结果见表2。

注：总平均疏水性指蛋白质序列所有氨基酸残基疏水性的平均值，说明蛋白质的溶解性，正值代表疏水，负值代表亲水；不稳定指数用于描述蛋白质一级结构的稳定性，若此值超过40则为不稳定蛋白；aa代表氨基酸。

Note:Grand Average Hydropathicity (GRAVY) is the average value of the hydropathicity of all amino acid residues in a protein,indicating the solubility of proteins.Positive GRAVY value means hydrophobic and negative GRAVY value means hydrophilic.Instability index is used to describe the stability of the primary structure of a protein and a value of >40 means the protein is unstable.aa means amino acid.

表2显示，HDAC家族蛋白氨基酸残基数为260～646。RPD3/HDA1亚家族的11个蛋白中，除HDA912等电点为8.77，呈碱性外，其他10个家族蛋白的等电点在5.06～6.29，均呈酸性；HDA912总平均疏水性为0.234，其他10个成员总平均疏水性在-0.071～-0.521，即属于亲水性蛋白；与之相对应，除了HDA912带正电外，其他RPD3/HDA1亚家族蛋白则是负电氨基酸残基数目多于正电氨基酸残基数目，带负电；在RPD3/HDA1亚家族的11个蛋白中，HDA901、HDA902、HDA903、HDA904、HDA905、HDA906和HDA912是稳定蛋白质，其他成员则属于不稳定蛋白质。HD2亚家族的3个成员具有一致的理化性质，等电点均在5.0左右，呈酸性，均带负电；总平均疏水性在-1.0左右，都属于亲水性蛋白；一级结构均不稳定。SIR2亚家族的2个成员的理化性质与其他2个亚家族略有不同，SRT901与SRT902的等电点在9.0左右，均呈碱性，负电氨基酸残基数目小于正电氨基酸残基数目，带正电，属于亲水性蛋白。总之，HDAC家族蛋白绝大多数都是亲水性(HDA912除外)和酸性(HDA912和SIR2亚家族除外)蛋白质。

2.2.2 磷酸化位点 蛋白质磷酸化是一种蛋白质翻译后修饰，在细胞信号传递过程中具有十分重要的作用，也是蛋白质活性的一种调节方式。Brosch等[44]和Kolle等[45]首次发现，玉米 HDAC受磷酸化的调节，磷酸化能够改变HDAC的酶活性和底物特异性。磷酸化位点分析结果(表3)表明，毛果杨HDAC也受磷酸化的调节，毛果杨HDAC家族成员在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸上均能发生磷酸化，但磷酸化位点主要发生在丝氨酸残基上。此外，不同的HDAC家族成员具有不同的磷酸化位点数。

2.2.3 亲/疏水性 蛋白质的功能往往是由其三维结构决定的，而氨基酸的亲/疏水性在一定程度上反应了蛋白质的折叠方式，这对蛋白质形成特定的功能具有非常重要的作用，且在维持生物膜的结构等方面具有一定作用。根据蛋白质的氨基酸组成及其所在的位置，可以预测蛋白质可能形成的二级结构。利用ExPaSy提供的ProtScale在线程序(http://expasy.org/tools/protscale.html),对毛果杨HDAC 3个亚家族的成员进行亲/疏水性分析，结果见图2。

图2 毛果杨HDAC家族蛋白疏水性预测HDA902、HDT901和SRT901分别代表毛果杨HDAC家族的RPD3/HDA1、HD2和SIR2亚家族蛋白,图3和图4同；方框代表疏水性氨基酸残基组成的有意义的跨膜螺旋
Fig.2 Hydrophobicity of HDACs inPopulustrichocarpaHDA902,HDT901 and SRT901 represent the RPD3/HDA1,HD2 and SIR2 sub-families,respectively;Box shows the position of significant trans-membrane helix

图2显示，HDAC家族大部分成员的亲/疏水性氨基酸分布较为均匀。例如，RPD3/HDA1亚家族的HDA902和SIR2亚家族的SRT901，其亲/疏水区域分布较为平均，只是HDA902的N-端亲水，而SRT901的N-端疏水。HDA902和SRT901的中后部均能形成由约20个疏水性氨基酸残基组成的跨膜螺旋。而HD2亚家族则不同于其他2个亚家族，其多由亲水性氨基酸组成，不能形成跨膜螺旋。HD2亚家族的3个成员HDT901、HDT902和HDT903的疏水性分布曲线相似，且都有3个主要的亲水区，主要分布在30-40以及120-200区域，多肽链N-端多是疏水性氨基酸，C-端多是亲水性氨基酸。

2.3 毛果杨HDAC家族蛋白的跨膜区和二级结构

2.3.1 跨膜区 跨膜区是转运蛋白行使底物结合等功能的重要结构，对氨基酸序列的跨膜区分析，在推断该蛋白在细胞中的功能及作用位点等方面具有重要参考意义。利用TMpred在线分析程序(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)对毛果杨HDAC家族蛋白进行了跨膜分析，结果(表4)显示，RPD3/HDA1亚家族的11个蛋白中，除HDA904外，其他10个蛋白都有不同数目的跨膜螺旋和跨膜方向，且都有一定数目的有意义的跨膜螺旋。HD2亚家族的3个蛋白比较特殊，均没有跨膜螺旋，这可能与其在细胞中的分布有关。SIR2亚家族蛋白的跨膜区与RPD3/HDA1亚家族基本一致，即有一定数目的跨膜螺旋和跨膜方向。总体而言，HDAC家族蛋白存在有意义的跨膜区，但数目不多(2～3个)。

以HDA902、HDT901和SRT901为例，详细说明HDAC不同亚家族蛋白跨膜区的特征，结果见图3。

HDA902在114-134、158-176、299-315区域形成了3个膜内到膜外的跨膜螺旋，其中心位置分别为124，166，307；在115-133、156-173、296-314区域形成了3个由膜外到膜内的跨膜螺旋，其中心位置分别为125，165和304(图3-A)。跨膜分析得分大于500才被认为是有意义的跨膜，因而在上述跨膜分析中，只有299-315的膜内到膜外和296-314的膜外到膜内的分析是有意义的跨膜。因此认为HDA902的跨膜区域在296-315处，长度约为20个氨基酸。在HDT901中没有发现有意义的跨膜区(图3-B)。SRT901在72-90和283-303区域可形成2个分别以82，293为中心的由膜内到膜外的跨膜螺旋，在280-300、305-324和338-354区域可形成3个分别以290，313，346为中心的由膜外到膜内的跨膜螺旋，但有意义的只有2处，分别是从283-303的膜内到膜外和280-300的膜外到膜内的跨膜，且各跨膜区长度约为21个氨基酸(图3-C)。

2.3.2 二级结构 蛋白质的二级结构是指其主链折叠产生的由氢键维系的有规则结构。利用PredictProtein在线程序(https://www.predictprotein.org/)对HDAC家族蛋白的二级结构进行了分析，结果(表5)显示，毛果杨HDAC家族蛋白二级结构以无规则卷曲为主。在RPD3/HDA1亚家族的11个蛋白中，除了HDA912无规则卷曲比例为49.66%外，其他10个蛋白无规则卷曲比例都在50%以上，β-折叠在10%左右，其余为α-螺旋。HD2作为植物特有的一类组蛋白去乙酰化酶，在二级结构上明显不同于其他2个亚家族成员。HD2亚家族中的3个成员HDT901、HDT902和HDT903均不含有α-螺旋，含有β-折叠和无规则卷曲，其中无规则卷曲比例较高，达80%左右。而SIR2亚家族各蛋白结构比例由高到低依次为无规则卷曲、α-螺旋和β-折叠。

分别以3个家族的HDA901、HDT901和SRT901为例，来说明α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲在HDAC不同亚家族蛋白质分子中的分布(图4)。RPD3/HDA1亚家族成员的α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲在整个蛋白分子各部位均有分布。HD2蛋白二级结构比较特殊，不含有α-螺旋，β-折叠位于蛋白质的N-端，其后为大段的无规则卷曲。SIR2蛋白的二级结构与RPD3/HDA1亚家族成员类似，其α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲散布于整个蛋白分子。

2.4 毛果杨HDAC家族蛋白亚细胞定位

研究HDAC家族蛋白的细胞定位，对于分析该蛋白的功能具有重要意义。对玉米、拟南芥和水稻等植物的研究表明，RPD3/HDA1亚家族蛋白定位于细胞核、细胞质或细胞器中[18]。利用WoLF PSORT在线软件(https://wolfpsort.org/)对毛果杨HDAC家族蛋白进行亚细胞定位分析，结果(表6)表明，毛果杨HDAC家族蛋白在细胞内分布比较广泛，但主要定位于细胞核，其次是细胞质和线粒体，有的在叶绿体、过氧化物酶体、液泡、内质网、细胞骨架等部位也有分布。在RPD3/HDA1亚家族的11个蛋白中，HDA901、HDA910和HDA912这3种蛋白没有定位于细胞核内，主要位于细胞器或细胞质中；HDA904、HDA905、HDA906主要定位在细胞质；其他的RPD3/HDA1亚家族成员主要定位在细胞核。此外，RPD3/HDA1亚家族蛋白的某些成员在过氧化物酶体、质膜、液泡、内质网、细胞骨架中也有少量分布，或者在细胞器之间穿梭。HDAC定位于细胞质或细胞器表明除了组蛋白外，其他非组蛋白类的蛋白质也可能是HDAC的作用底物。HD2亚家族的3个蛋白主要定位在细胞核，只有HDT901在线粒体有少量分布。SIR2亚家族的SRT901主要定位于线粒体，也穿梭于叶绿体-线粒体和细胞质之间；而SRT902在细胞中定位广泛，主要分布于细胞核、细胞质和叶绿体中。

2.5 毛果杨HDAC家族蛋白的三级结构预测

利用在线分析工具SWISSMODEL同源建模服务器对毛果杨HDAC家族蛋白的三级结构进行预测，方法为同源比对建模的方式，取Blast之后期望值(E值)最小的三级结构进行建模，预测蛋白质的三级结构。结果(图5)显示，HDAC家族16种蛋白的三级结构可分为6种类型。RPD3/HDA1亚家族中HDA902、HDA903、HDA904、HDA908和HDA909三级结构相似度较高；HDA901、HDA905、HDA906和HDA907三级结构相似度较高；HDA912具有独特的结构，不同于其他的在进化上与之相近的蛋白质(如HDA901、HDA905、HDA906和HDA907)；HDA910与其他RPD3/HDA1 亚家族蛋白在序列上存在差异，其三级结构也有差异。HD2亚家族序列在SWISSMODEL预测中无三级结构，可能由于其二级结构缺少α-螺旋所致。SIR2亚家族共有2个成员，2个成员间序列差异较大，三级结构无相似性。总体而言，HDAC在三级结构上有共同之处，即主要由5～8个同向的β-折叠排列形成β-片层结构，外面由6～9个α-螺旋包围；但不同类别的HDAC所拥有的α-螺旋和β-折叠在数目及空间排布有所不同。在三级结构上相似度高的HDAC家族成员可能具有相近的功能，三级结构明显不同的HDAC蛋白在功能上可能存在差别。

2.6 ABA对毛果杨HDAC家族基因表达的影响

本研究采用实时荧光定量PCR方法，分析了毛果杨叶片HDAC家族基因的表达，结果见图6。

图6 ABA处理对毛果杨叶片HDAC家族基因表达的影响HDAC基因相对表达水平指与处理前(0 h)比较的相对值，* 表示基因表达与处理前相比差异达到显著水平(P<0.05 )
Fig.6 Expression of leaf HDAC genes inPopulustrichocarpain response to ABA treatment The expression levels of 16 HDAC genes are relative to their respective transcription levels before ABA treatment. * represents significant difference (P<0.05)

图6表明，毛果杨HDAC家族基因的表达受ABA的调节，不同家族成员对ABA的应答反应不同。ABA处理6 h显著提高了毛果杨HDA901、HDA903和HDT901基因的表达，其中HDA901的表达水平较对照(0 h)提高了2.1倍。而ABA处理24 h显著降低了HDA907和HDT901基因的表达，其中HDT901表达水平较对照(0 h)下降了约2/3。HDA901和HDT901这2个基因的表达水平受ABA处理时间的影响，这2个基因在ABA处理早期(6 h)表达上调，在ABA处理晚期(24 h)表达下调。

3 讨 论

在众多植物中，人们对拟南芥HDAC家族基因的功能研究相对比较清楚，如拟南芥AtHDA6、AtHDA19和AtHD2C等。本研究对毛果杨HDAC家族成员和拟南芥HDAC家族成员进行系统进化树分析，结果显示，毛果杨RPD3/HDA1亚家族中的PtHDA902和 PtHDA903与拟南芥AtHDA19处于一个进化分支，在氨基酸序列上具有很高的同源性，相似性分别达85%和83%。毛果杨PtHDA908和 PtHDA909与拟南芥AtHDA6处于一个进化分支，其氨基酸序列上与拟南芥AtHDA6具有很高的同源性，相似性分别达82%和79%。毛果杨3个HD2蛋白(PtHDT901、PtHDT902和PtHDT903)与拟南芥AtHDT3处于同一进化分支。进化途径相似、同源性高预示这些蛋白可能具有相似的功能。而拟南芥AtHDA19、 AtHDA6、AtHDT3已经被证明参与了生长发育的调节及多种生物和非生物胁迫的应答反应，故推测PtHDA902、PtHDA903、PtHDA908、PtHDA909和HD2蛋白很可能在毛果杨生长发育和胁迫应答反应中发挥重要的调节作用。

本研究经过多种分析后发现，毛果杨HD2亚家族蛋白与其他HDAC亚家族成员有很大差异。二级结构分析显示，毛果杨HD2亚家族3个成员均不含α-螺旋，也不含跨膜螺旋。α-螺旋一般是由疏水性氨基酸疏水作用形成的，是跨膜蛋白中跨膜螺旋的主要组成部分。毛果杨HD2亚家族蛋白的氨基酸序列富含亲水性氨基酸，不易形成α-螺旋，而α-螺旋的缺失导致其跨膜功能丧失。据此推测，毛果杨HD2亚家族蛋白不是膜蛋白，很可能是可溶性蛋白。对毛果杨HDAC家族蛋白进行了亚细胞定位预测和分析，结果表明，毛果杨HD2蛋白几乎只在细胞核内分布，与拟南芥和玉米HD2蛋白相同[18]。HD2蛋白在氨基酸组成、结构和细胞定位上的独特性，暗示其生理功能可能不同于HDAC的其他亚家族成员。

ABA调节HDAC基因的表达是植物对ABA应答反应的一部分。一些研究表明，ABA能够抑制HDAC基因的表达。例如ABA处理24 h能够抑制水稻HDAC一些基因，如HDT701、HDT702、SRT701和SRT702的表达[15]；ABA处理6 h能够抑制拟南芥HD2亚家族基因(包括HD2A、HD2B、HD2C和HD2D)的表达[41,43]；Zhang等[46]的研究表明，ABA处理48和72 h后均能抑制玉米HDAC基因(包括HDA101、HDA102、HDA106、HDA108、HD1B和HD2)的表达。此外，不同的HDAC家族成员可能对ABA的反应也不同，如大麦HvHDAC2-1 在ABA处理24 h时转录水平显著提高；而HvHDAC2-2 在ABA处理24 h时转录水平则没有显著变化，在ABA处理6 h时转录水平下降[47]。

目前，对杨树HDAC基因的表达和功能研究尚未见报道。本研究分析了ABA处理条件下毛果杨HDAC基因的表达，结果表明，某些HDAC基因的表达受ABA的调节，暗示这些HDAC基因可能参与ABA信号反应过程。ABA处理6 h时，HDA901基因的表达上调了2倍以上，这与前人在大麦[47]中的研究相似，大麦HvHDAC2-1的表达也受ABA的诱导[47]。而ABA处理24 h能够抑制毛果杨HD2亚家族成员HDT901的表达(下降了近2/3)，这与在拟南芥[41-42]、水稻[15]和玉米[46]中的研究相似，即ABA处理能够抑制HDAC的表达。在大多数的研究中，HDAC基因的表达是受ABA抑制的，HDAC基因的抑制可能与ABA和逆境胁迫条件下染色体重塑有关[48]，进而影响与ABA和胁迫反应相关基因的表达，使植物对胁迫和相关生理过程做出应答反应。

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Sequence and gene expression of histone deacetylases (HDAC) gene family ofPopulustrichocarpa

LI Shu-juana,ZHANG Chaoa,ZHANG Yan-nib,DONG Ya-rub,MA Xu-juna

(aStateKeyLaboratoryofTreeGeneticsandBreeding(NortheastForestryUniversity),bSchoolofLandscape,NortheastForestryUniversity,Harbin,Heilongjiang150040,China)

【Objective】 The sequence and expression of histone deacetylase (HDAC) family genes ofPopulustrichocarpaand their response to ABA were investigated to provide useful information for future functional studies.【Method】 16 HDAC proteins fromPopulustrichocarpawere analyzed with the bio-informatics tools.The expression levels of the 16 HDAC family genes in leaves after 100 μmol/L ABA treatment for 6 and 12h were analyzed using real-time PCR.【Result】 The populus HDACs could be classified into three sub-families,including RPD3/HDA1,HD2 and SIR2,and they had close relationship with HDACs fromArabidopsisthaliana.Almost all of the HDACs (except HDA912) were hydrophilic proteins and their isoelectric points (pI) were low (except for HDA912 and SIR2 sub-family).HDACs activities were regulated by phosphorylation,whichmajorly occured at the serine residues.Most of the populus HDACs had trans-membrane helices with different numbers and directions,whereas no helices were predicted in HD2 proteins.For RPD3/HDA1 and SIR2 proteins,the secondary structures included α-helices,β-strands and loops,and the percentages of loops were as high as 50% (except for HDA912).The three populus HD2 proteins had no α-helices in their secondary structures,and the loops were their primary secondary structure,accounting for ～80%.Populus HDACs were majorly localized in nucleus.They also distributed in organelles,cytoplasm or membrane components,whereas HD2 proteins were exclusively localized in nucleus. The tertiary structures of populus HDACs could be classified into 6 types,suggesting that they may have different functions.Real-time PCR analysis showed that the expression ofHDA901,HDA903 andHDT901 genes were significantly improved by 6 h ABA treatment,whereas the expression ofHDA907 andHDT901 gene were significantly down-regulated by 24h ABA treatment. 【Conclusion】 The populus HD2 sub-family members,as plant specific histone deacetylases,were found different in many properties from other HDAC members.The expressions of HDAC genes were regulated by ABA and different HDAC members responded differently.

Populustrichocarpa;histone deacetylase;bio-informatics;abscisic acid (ABA);gene expression

2013-10-28

国家自然科学基金青年科学基金项目(31200497)；中央高校青年教师自主创新基金项目 (DL12BA01)；黑龙江省博士后基金项目(LBH-Z13006)；国家“863”高技术研究发展计划项目(2013AA102701)

李淑娟(1967-)，女，黑龙江哈尔滨人，副教授，主要从事林木遗传育种研究。E-mail:lishujuan@126.com

马旭俊(1974-)，女，黑龙江哈尔滨人，讲师，主要从事林木遗传育种研究。E-mail:mxj3000@sina.com

时间:2015-01-19 09:19

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.03.001

S792.119；Q78

A

1671-9387(2015)03-0063-14

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150119.0919.001.html