CTLA-4抗体抑制小鼠Lewis肺癌生长的实验研究

崔　倪，王建霞，张海英，李祎南，李明月，邢树刚，李　伟*,李一雷*

(1.吉林大学基础医学院病理学系，病理生物学教育部重点实验室，吉林 长春130021；

2.吉林大学白求恩医学部临床医学院2011级5年制，吉林 长春130021)

CTLA-4抗体抑制小鼠Lewis肺癌生长的实验研究

崔倪1,2，王建霞1，张海英1，李祎南1，李明月1，邢树刚1，李伟1*,李一雷1*

(1.吉林大学基础医学院病理学系，病理生物学教育部重点实验室，吉林 长春130021；

2.吉林大学白求恩医学部临床医学院2011级5年制，吉林 长春130021)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0532)

近年来，细胞毒性T细胞抗原(cytotoxic T lymphocyte antigen-4， CTLA-4)已经成为肿瘤免疫治疗的关键生物靶点，对恶性黑色素瘤的治疗具有显著疗效，但对其它肿瘤的疗效尚不确定[1,2]，并且CTLA-4抗体处理后对体内肿瘤血管新生情况的影响尚未见报道。本项目拟制备小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤模型，研究CTLA-4单克隆抗体对小鼠肺癌生长的影响，观察肿瘤微环境内免疫状态及血管新生情况。

1材料与方法

1.1实验动物及肿瘤细胞系C57BL/6雄性小鼠，6-8周龄，体重18-22 g，购自吉林大学基础医学院实验动物中心。小鼠Lewis肺癌细胞系来自吉林大学病理生物学教育部重点实验室。细胞置于5% CO2，37℃孵箱中，用含10%胎牛血清DMEM培养基培养。

1.2药物及主要试剂小鼠抗CTLA-4单克隆抗体9H10(Bioxcel公司，美国)，胎牛血清，DMEM培养基(Invitrogen， 美国)，兔抗鼠CD4抗体、兔抗鼠CD8抗体、兔抗鼠CD34抗体、SP免疫组化试剂盒及DAB发色剂(福州迈新生物技术有限公司)。

1.3小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤的制备小鼠Lewis肺癌细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，传代2-3次后，取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，1000 r/min离心5 min，弃上清,加0.9%的生理盐水悬浮细胞，调整细胞浓度至1.0×106/ml，接种于小鼠右侧后背部皮下，每只注射0.1 ml。

1.4实验动物分组及给药将建立移植瘤的小鼠随机分为实验组和对照组，每组6只。实验组在接种肿瘤当天(D0)开始注射CTLA-4抗体9H10，抗体腹膜内注射，剂量100 μg/只，每3天注射2个50 μg，至第21天。对照组注射相同剂量的生理盐水。

1.5移植瘤平均体积、重量及肿瘤抑制率检测治疗开始日为第1天，每3天测量肿瘤的最大直径(a)和最大横径(b)并计算体积，绘制肿瘤生长曲线。共治疗21天，治疗结束后第2天首先采用摘眼球取血法取小鼠外周血，再采用颈椎脱臼法处死所有小鼠，取出脾，肿瘤测量体积，计算肿瘤生长抑制率。肿瘤体积(V)=a×b2/2；肿瘤生长抑制率=(对照组瘤重-实验组瘤重)/对照组瘤重×100%。

1.6标本处理与免疫组织化学染色肿瘤组织及脾置10%中性福尔马林缓冲液固定，经脱水、浸蜡及包埋后，切3 μm厚切片。用柠檬酸抗原修复液进行抗原热修复，加封闭液后，滴加一抗4℃过夜，次日加生物素化羊抗兔IgG，37℃孵育30 min，ABC法显色，显微镜下观察到棕黄色即放入自来水中终止显色。苏木精复染细胞核1-3分钟，固定后光镜下观察并拍照。

1.7结果判定标准Olympus显微镜成像系统，DP73照相机采图，镜下避开中间因血液供应不足而造成的坏死明显部位及其边缘，在肿瘤周围生长旺盛的部位采图，每张切片采集5个视野，双盲法进行计数。CD4及CD8阳性颗粒主要定位于淋巴细胞膜，以淋巴细胞膜中出现棕黄色为阳性标准，在显微镜下随机选取5个视野，计算每个视野中阳性细胞数占总细胞数的百分比。CD34阳性内皮细胞被染成棕黄色。在低倍镜下寻找血管密集的部位采图，每张切片采集5个视野，双盲法进行计数，单个阳性细胞、独立阳性小细胞团或者一个小管腔计为一个血管。MVD = CD34阳性管腔数均值。

2结果

2.1C57 荷Lewis肺癌小鼠生长曲线分析移植瘤接种3天后，荷瘤小鼠开始出现肿瘤，空白对照组小鼠的肿瘤体积随时间逐渐增大，局部呈结节状。按照JP.Allison文献里报道的标准，肿瘤体积≥1cm3记为死亡。实验结果显示：与空白对照组相比较，应用anti-CTLA-4组可以延缓荷瘤小鼠的肿瘤生长速度，延长其生存时间(图1)。

将1×106个细胞注入小鼠后背部皮下，接种第3天开始用药，直到用药到21天，用药期间测量肿瘤大小，绘制肿瘤生长曲线。

图1荷瘤小鼠生长曲线

2.2CTLA-4抗体对Lewis肺癌荷瘤小鼠脾组织中CD4及CD8阳性T细胞表达的影响为了明确CTLA-4抗体对Lewis肺癌荷瘤小鼠细胞免疫能力的影响，于用药21天后，处死小鼠取脾组织，用免疫组织化学染色检测荷瘤小鼠脾脏中CD4及CD8阳性T细胞的表达。结果显示，实验组与对照组CD4阳性T细胞的数量分别为(49.05±7.31)%和(23.45±8.06)%，与对照组比较，应用CTLA-4抗体处理后CD4表达阳性率显著增高，具有统计学意义(P<0.01)(图2-1，2-2)。实验组和对照组中CD8表达的阳性率分别为17.25±2.86和11.32±0.71，与对照组比较，应用CTLA-4抗体处理后CD8表达的阳性率明显增高，具有统计学意义(P<0.05)(图3-1,3-2)。

CD4主要表达在T淋巴细胞的胞膜。A：对照组；B：CTLA-4抗体组。

图2-1免疫组织化学染色检测荷瘤小鼠脾组织中CD4的表达(SP法.x400)图2-2CTLA-4抗体对荷瘤小鼠脾组织

内CD4表达阳性率的影响

2.3CTLA-4抗体对荷瘤小鼠肿瘤微环境中微血管密度的影响为了检测CTLA-4抗体对肿瘤微环境中血管新生情况的影响，我们用抗CD34单克隆抗体标记肿瘤微血管内皮细胞，计数肿瘤间质微血管密度(MVD)值。结果显示，空白对照组MVD为75.72±14.49，CTLA-4抗体组MVD为37.20±2.84，与空白对照组比较，CTLA-4抗体处理后，肿瘤MVD值明显降低，具有统计学意义(P<0.001)。(图4-1，4-2 )。

CD8主要表达在T淋巴细胞的胞膜。A：对照组；B：CTLA-4抗体组。

图3-1免疫组织化学染色检测荷瘤小鼠脾组织中CD8的表达(SP法.x400)图3-2CTLA-4抗体对荷瘤小鼠脾组织

内CD8表达阳性率的影响

A：对照组；B：CTLA-4抗体组

图4-1荷瘤小鼠脾组织中CD34的表达。(SP法.x200)图4-2CTLA-4抗体对荷瘤小鼠肿瘤组织

内微血管密度的影响

3讨论

细胞毒性T细胞抗原(CytotoxicTlymphocyteantigen，CTLA-4)是白细胞表面的跨膜蛋白CD152，在机体的免疫调控中，这些分子竞争性地与T细胞表面的CD28结合，阻碍T细胞活化，对免疫起负调控作用[3,4]。在肿瘤发生时，肿瘤间质中大量聚集的免疫细胞表面的CTLA-4及其相应的受体表达上调，使免疫细胞处于失活状态，肿瘤细胞逃逸免疫监视[5,6]。近年来CTLA-4已经成为肿瘤免疫治疗的关键生物靶点，抗CTLA-4抗体目前已被美国食物与药品监督管理局批准为治疗恶性黑色素瘤的临床用药，但对其它肿瘤的疗效尚不确定，并且CTLA-4抗体治疗后对体内肿瘤血管新生情况的影响尚未见报道[1，2，7,8]。

本实验制备小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤模型，进而应用CTLA-4单克隆抗体检测对小鼠肺癌生长的影响，观察肿瘤微环境内免疫状态及血管新生情况，为进一步揭示肿瘤血管新生与免疫抑制之间的调控网络提供实验依据。研究结果显示，应用CTLA-4抗体可延缓荷瘤小鼠的肿瘤生长速度，延长其生存时间。CTLA-4抗体处理21天后，取荷瘤小鼠脾脏，监测免疫学指标的变化。实验结果显示，与对照组比较，应用CTLA-4抗体处理后，荷瘤小鼠脾组织中CD4及CD8阳性T细胞均明显增多。其可能机制为：抗CTLA-4抗体阻断了肿瘤浸润T淋巴细胞表面的CTLA-4-B7信号传导通路，有效地阻断了抑制性信号的活化，同时提高肿瘤浸润性CD4及CD8阳性T细胞的数量及相关细胞因子的分泌[9]。CD8阳性T细胞为细胞毒性T细胞，在细胞介导的抗肿瘤免疫中发挥重要作用[10,11]。CD4T细胞分为辅助性T细胞(Thcells)和调节性T细胞(Tregcells)，其中Th1细胞介导细胞免疫，可以协同激活细胞毒性T细胞，Th2则介导体液免疫，主要激活B细胞，Treg细胞为抑制性T细胞[12,13]。本研究中CTLA-4抗体处理后CD4阳性T细胞百分比增高，其中辅助性T细胞及调节性T细胞所占比例以及它们在抗肿瘤免疫中的作用有待于进一步通过流式细胞学检测证实。

肿瘤生长到几个立方毫米时处于缺氧状态，肿瘤细胞通过分泌缺氧诱导因子(hypoxiainduciblefactor-1,HIF-1)及VEGF等细胞因子促进CD4阳性T细胞向Treg细胞分化，Treg细胞可释放VEGF等，诱导血管生成，还可通过分泌细胞因子，如IL-6、IL-17等，激活stat3转录因子，间接诱导肿瘤血管新生[14,15]。肿瘤间质内的新生血管可以为肿瘤生长提供氧气和营养物质，促使肿瘤细胞的增殖和转移，并且有助于免疫抑制细胞向肿瘤微环境聚集[16]。因此，肿瘤诱导的免疫抑制和促进血管新生之间形成了一个相互诱导的有利于肿瘤生长的调控网络。本研究中，我们采用免疫组化染色标记荷瘤组织微环境中微血管内皮细胞，计算肿瘤微血管密度(MVD)值，结果显示经CTLA-4抗体治疗后，荷瘤小鼠Lewis肺癌间质中的MVD显著降低。由此可见，在肿瘤微环境中，免疫细胞处于失活抑制状态，免疫抑制细胞释放的炎症因子诱导肿瘤血管生成，新生的血管又为肿瘤细胞的生长和转移提供必要的条件[6]。抗CTLA-4抗体不但能够激发肿瘤特异性T细胞继续增殖，激活免疫系统对肿瘤的杀伤作用，提高机体对抗肿瘤的主动免疫作用，同时也能有效地阻断肿瘤间质的微血管生成[7]。

综上所述，本研究结果表明应用抗CTLA-4单克隆抗体可有效地提高荷瘤小鼠Lewis肺癌微环境中CD4及CD8阳性T细胞的数量，同时抑制肿瘤间质的血管生成。为以CTLA-4为靶点进行肺癌的治疗研究提供了实验证据。

注：该项目参加了2012年度 吉林大学“挑战杯”大学生课外学术科技作品竞赛。

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摘要：目的研究抗CTLA-4(cytotoxic T lymphocyte antigen-4，CTLA-4)抗体(9H10)对小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用及其机制。方法选取健康适龄C57小鼠，皮下接种小鼠Lewis肺癌细胞系，建立皮下移植瘤模型。12只荷瘤小鼠分为2组，分别为空白对照组和实验组，分别腹腔注射给予生理盐水和CTLA-4抗体(9H10)，通过肿瘤体积、重量及肿瘤生长抑制率评估9H10的抑瘤作用；免疫组织化学染色检测脾组织T细胞亚型(CD4及CD8阳性T细胞)及肿瘤微血管密度(MVD)，通过组间对照分析抗CTLA-4对肿瘤微环境免疫细胞及血管生成的影响。结果CTLA-4抗体可延缓荷瘤小鼠的肿瘤生长速度，延长其生存时间。免疫组织化学染色检测荷瘤小鼠脾脏中CD4及CD8阳性T细胞。结果显示，实验组与对照组CD4阳性T细胞的数量分别为(49.05±7.31)%和(23.45±8.06)%，与对照组比较，应用抗CTLA-4处理后CD4表达阳性率明显增高，具有统计学意义(P<0.01)。实验组和对照组中CD8表达的阳性率分别为17.25±2.86和11.32±0.71，与对照组比较，应用抗CTLA-4处理后CD8表达的阳性率明显增高，具有统计学意义(P<0.05)。用抗CD34单克隆抗体标记肿瘤微血管内皮细胞，计数肿瘤间质MVD。实验组和对照组的MVD值分别为37.20±2.84和75.72±14.49， CTLA-4使肿瘤MVD明显减少，具有统计学意义(P<0.001)。结论CTLA-4抗体对荷瘤小鼠Lewis肺癌具有抑制作用，荷瘤小鼠脾组织中CD4 及CD8表达均增高，肿瘤间质的MVD值显著降低。CTLA-4在提供机体抗肿瘤免疫及抑制肿瘤血管生成中均发挥重要作用。

关键词：Lewis肺癌；细胞毒性T细胞抗原-4(CTLA-4)；CD4；CD8；肿瘤血管

Inhibition of Anti-Cytotoxic T Lymphocyte Antigen 4 Antibody on the Growth of Lewis Lung CancerCUINi,WANGJian-xia,ZHANGHai-ying,etal.(DepartmentofPathology,SchoolofBasicMedicalSciences,KeyLaboratoryofPathobiology,MinistryofEducation,JilinUniversity,Changchun130021,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the antitumor effects of cytotoxic T lymphocyte antigen-4 antiboby(9H10)on mice Lewis lung cancer.MethodsThe transplantation tumor models were established by injection of Lewis lung cancer cells subcutaneously to C57BL/6 mice.Twelve mice were randomly divided into two groups:The 9H10 therapy group with intraperitoneal injection of cytotoxic T lymphocyte antigen-4 antibody and the control group with the injection of 0.9% sodium chloride respectively.The antitumor effects were investigated by measuring tumor volume,the dynamic change of tumor weight and the inhibition rate of tumor growth.The expression ratio of CD4 and CD8 positive T cells in spleen were detected by immunohistochemistry.Microvessel density (MVD) was assessed by CD31 immunostaining.ResultsThe growth rate of tumor bearing mice were delayed and the survival time were prolonged.The CD4 positive T cells in the spleen of tumor bearing mice were 49.05±7.31% and 23.45±8.06% in 9H10 group and control group respectively.The positive rate of CD4 T cells were significantly increased comparing with control group after CTLA-4 antibody treatment (P<0.01).The CD8 positive T cells were 17.25±2.86 and 11.32±0.71 in 9H10 group and control group respectively.The positive rate of CD8 T cells were significantly increased in the experimental group than in the control group(P<0.05).The tumor interstitial microvessel density (MVD) were 37.20±2.84和75.72±14.49 in the experimental group and control group respectively.The MVD significantly decreased after CTLA-4 antibody treatment (P<0.01).ConclusionThe growth of Lewis lung cancer were inhibited after CTLA-4 antibody treatment.The expression ratio of CD4 and CD8 positive T cells were both increased and the MVD value was lowered in the spleen of Lewis cancer bearing mice after CTLA-4 antibody treatment.CTLA-4 may play significant roles both on increasing the tumor immune and inhibiting tumor angiogenesis.

Key words:Lewis lung cancer;CTLA-4;CD4;CD8 Tumor angiogenesis

收稿日期：(2014-05-09)

文献标识码：A

中图分类号：R734.2

文章编号：1007-4287(2015)04-0532-05

通讯作者*

基金项目:吉林省科技厅自然科学基金资助课题(20130102084JC)；吉林大学白求恩医学科研支持计划资助课题(2013101005)；吉林大学“大学生创新创业训练计划”国家级项目资助课题(2013A71249)