糠醛渣直接同步糖化发酵生产乙醇过程比较研究

吉 骊， 王永淼， 唐 勇， 刘志平， 蒋建新*

(1.北京林业大学 林业生物质材料与能源教育部工程研究中心，北京 100083； 2.河北春蕾集团，河北 邢台 054001)

·研究报告——生物质能源·

糠醛渣直接同步糖化发酵生产乙醇过程比较研究

吉 骊1， 王永淼1， 唐 勇1， 刘志平2， 蒋建新1*

(1.北京林业大学 林业生物质材料与能源教育部工程研究中心，北京 100083； 2.河北春蕾集团，河北 邢台 054001)

以糠醛渣为原料，直接同步糖化发酵(SSF)生产乙醇，并与水洗糠醛渣生产乙醇进行对比。通过考察不同条件来优化同步糖化发酵生产工艺条件，并分析表征了SSF过程中乙醇浓度和副产物浓度变化。优化条件为：糠醛渣底物质量分数10%，纤维素酶用量12%，无患子皂素质量浓度0.5 g/L，酵母接种量7 g/L，同步糖化发酵乙醇得率达到其理论得率的93.1%。与水洗糠醛渣相比，糠醛渣直接SSF过程可将原料吸附的5.50%葡萄糖部分转化为乙醇。水洗糠醛渣SSF生产乙醇所产生的副产物要远低于糠醛渣直接生产所产生的副产物，添加无患子皂素可有效抑制糠醛渣同步糖化发酵过程中副产物的产生。

糠醛渣；同步糖化发酵；乙醇；副产物；无患子皂素

利用可再生木质纤维原料及农林废弃物生产燃料乙醇已成为全世界研究热点[1]，同时还能生产乳酸等高附加值产品[2]。糠醛是一种重要的化工原料，以农林废弃物为生产原料。糠醛生产过程中，伴有大量糠醛废渣产生[3]，糠醛废渣中含有较丰富的纤维素，几乎不含半纤维素，是生产纤维素及其转化产品的潜在原料[4]。以糠醛渣为原料生产乙醇及其它化学品有许多的研究成果[5-9]，为糠醛渣的利用提供了一条途径。在已报道的有关糠醛渣糖化发酵生产乙醇或其它化学品的论文或专利中，糠醛渣首先经过水洗去除其中的糖化发酵抑制物，而糠醛渣水洗过程中必然产生大量的废水[10-11]。作者研究了糠醛渣直接同步糖化发酵产乙醇的条件，并与水洗糠醛渣原料的同步糖化发酵产乙醇进行对比，通过添加无患子皂素表面活性剂以降低抑制物的影响，以期为糠醛渣中的纤维生产乙醇提供理论依据。

1 实 验

1.1 原料与试剂

糠醛渣(水分质量分数50.5%，河北春蕾集团)，选择粒径小于0.90 mm的颗粒于密封袋保存。水洗糠醛渣，将糠醛渣用去离子水洗涤至中性，压滤，使水分质量分数为54.2%，选择粒径小于0.90 mm的颗粒装入密封袋备用。安琪酿酒活性干酵母，耐高温型；夏实纤维素酶，酶活35 FPIU/g；2%葡萄糖溶液；10%氢氧化钠；10%硫酸；无患子皂素，从无患子果皮中提取，实验室自制，纯度为76.7%；同步糖化发酵(SSF)培养基：1 g/L玉米浆，0.5 g/L磷酸氢二铵，0.025 g/L七水合硫酸镁。

1.2 装置

HZ-9212S型恒温水浴摇床(常州捷中捷仪器制造有限公司)、L-550型台式低速离心机(英泰仪器)、Waters 2695e型液相色谱仪、YXQ-LS-5型全自动灭菌锅(众泰达工业)、Schneider型压滤机、水解发酵瓶(自制)。

1.3 实验方法

1.3.1 酵母的活化 取1 g干酵母投入已灭菌的50 mL 2%的葡萄糖水溶液中,在100 r/min水浴摇床上进行活化。36 ℃活化15 min后，降温至34 ℃，活化60 min。

1.3.2 糠醛渣同步糖化发酵生产乙醇 称取一定量的糠醛渣样品和SSF培养基于100 mL自制发酵瓶中，达到一定底物浓度，并用水洗糠醛渣作对照。用质量分数10%的硫酸和氢氧化钠调节混合液的pH值至5.5后，121 ℃灭菌20 min，取出后以3.5～7.0 g/L接种量加入活化好的酵母、纤维素酶，以及无患子皂素在38 ℃、转速130 r/min的条件下厌氧发酵。定时取样，每次取约1 mL发酵液，离心分离。用于分析检测葡萄糖浓度和乙醇浓度。

1.4 分析方法

糠醛渣及水洗糠醛渣中木质素与纤维素含量依照美国可再生能源国家实验室(NREL)标准方法测定。葡萄糖和乙醇浓度采用Waters2695e型液相系统进行分析，经美国伯乐公司Aminex HPX-87H (300 mm×7.8 mm) 柱进行分离。柱温65 ℃，示差折光检测器温度为30 ℃， 5 mmol硫酸流速为0.6 mL/min，进样量1 μL。乙醇得率公式如下：

2 结果与讨论

2.1 原料组分分析

表1为糠醛渣和水洗糠醛渣化学组成分析。在高温稀酸条件下处理后，原料中的戊聚糖转化为糠醛，因此糠醛渣中半纤维素含量很低，从而减少了半纤维素对纤维素酶解的空间阻碍作用。从表1可以看出，糠醛渣中纤维素占30.61%，含5.5%游离葡萄糖；水洗后的糠醛渣含纤维素33.08%，纤维素含量相对于绝干物料有所提高，但水洗过程却损失了其中的游离葡萄糖。

表1 糠醛渣原料组成

1)以绝干糠醛渣质量计calculated by the mass of dry furfural residues

2.2 同步糖化发酵条件对转化过程的影响

糠醛渣发酵生产乙醇的主要反应条件为底物质量分数、纤维素酶用量(以纤维素质量计，下同)、酵母和皂素用量(具体见表2)，实验通过固定其他条件研究某一反应条件对糠醛渣发酵产乙醇的影响，结果见表3。在糠醛渣同步糖化发酵过程中，发酵72h后乙醇质量浓度便可达到最大[12]。由表3可以看出，相同条件下水洗后的糠醛渣经同步糖化发酵后的乙醇得率低于未处理的糠醛渣，这与未洗糠醛渣所残留5.5%的葡萄糖有关。液相分析表明，发酵液中不存在游离的葡萄糖和纤维二糖(数据未给出)，说明酶水解产生的葡萄糖全部被利用。

表 2 不同反应条件的确定

表3 不同条件下糠醛渣同步糖化发酵对乙醇及副产物浓度的影响

2.2.1 底物质量分数 由表3可以看出提高底物质量分数(5%～10%)，糠醛渣经发酵后，乙醇得率随之升高，这与原料中吸附的游离葡萄糖有关；而水洗糠醛渣发酵后的乙醇得率则随底物浓度升高而降低，符合一般规律(底物浓度升高，体系黏度增加，影响传质效率，乙醇得率降低)[13]。糠醛渣和水洗糠醛渣同步糖化发酵过程产生的副产物质量浓度如表3所示。由表3可知，糠醛渣直接同步糖化发酵所产生的副产物质量浓度要远高于水洗糠醛渣，尤其是乳酸和乙酸要高出10倍左右。乳酸可能是其他干扰物导致测定值偏高，而乙酸则是原料残留。在糠醛渣直接同步糖化发酵反应体系中，底物质量分数提高，发酵副产物浓度增加。

2.2.2 酶用量及酵母接种量 随着酵母质量浓度升高(3.5～7 g/L)，5%糠醛渣生产乙醇的最终得率却有所降低(52%至46%)，10%水洗糠醛渣生产乙醇最终得率有一定升高(24.6%至31%)。降低酵母用量，有利于降低副产物的产生。此外，相同条件下若降低纤维素酶用量(6%至3%)，乙醇产率显著降低。因此，需对纤维素酶用量进行深入研究。

2.2.3 无患子皂素用量 添加无患子皂素对5%底物质量分数的糠醛渣发酵影响不大，而对10%底物质量分数的水洗糠醛渣生产乙醇有一定的促进作用：最终乙醇质量浓度由5.3 g/L提高至6.91 g/L，这与水洗糠醛渣反应体系中的木质素含量高有关。表面活性剂可以降低木质素对纤维素酶的无效吸附。在这几组发酵实验中，乙醇最高得率在d1条件下获得，其最终乙醇质量浓度为10.61 g/L，乙醇得率可达61.3%。此外，添加无患子皂素表面活性剂可降低副反应的发生程度。

2.3 纤维素酶用量对转化过程的影响

在糠醛渣与水洗糠醛渣同步糖化发酵过程中，乙醇质量浓度会随加酶量的变化而改变。在底物质量分数10%、酵母质量浓度7.0 g/L条件下，纤维素酶用量对发酵的影响结果见表4。由表4可知，在相同的底物质量分数及酵母浓度条件下，糠醛渣直接发酵后的乙醇质量浓度随着加酶量的增加有明显提高，当加酶量由6%增加至12%时，最终乙醇质量浓度由12.3 g/L提高到18.4 g/L。同样，最终乙醇得率也由58.4%提高至93.1%，这对于乙醇发酵是十分有利的。但另一方面也说明糠醛渣中木质素对纤维素酶有较大程度的无效吸附，导致用酶量比较大。由表4还可看出，在相同条件下，水洗糠醛渣乙醇发酵最终质量浓度为10.09 g/L，低于糠醛渣直接同步糖化发酵的乙醇质量浓度，说明糠醛渣中游离葡萄糖对乙醇浓度的贡献不可忽视。

表4 加酶量对糠醛渣同步糖化发酵乙醇及副产物的影响

发酵过程副产物的检测表明，糠醛渣直接同步糖化发酵所产生的副产物远高于水洗糠醛渣。在乙醇发酵过程中，甘油在乙醇发酵起始过程中起重要作用[14]。甘油的产生是为了维持细胞内渗透压的稳定，保持NAD+/NADH在酵母细胞中的平衡，其生物效应是对低氧化还原电位的响应[15]。从表4可以看出，甘油的浓度在不同发酵条件下波动较大。对比无患子皂素添加前后的结果可知，添加0.5 g/L皂素时，乳酸、乙酸、甘油的最终浓度较低，说明添加无患子皂素作为表面活性剂，可有效抑制未水洗糠醛渣同步糖化发酵过程中副产物的产生。

3 结 论

3.1 原料的组分分析表明，糠醛渣含纤维素30.61%，木质素44.34%，并且自身吸附有5.5%游离葡萄糖。经水洗后可以提高纤维素含量，并去除部分抑制物，但游离葡萄糖也随水洗过程而损失。

3.2 糠醛渣同步糖化发酵(SSF)生产乙醇的优化工艺条件为：底物质量分数10%，纤维素酶用量12%，酵母质量浓度7 g/L，无患子皂素0.5 g/L。乙醇得率可达其理论值的93.1%。相同条件下经水洗后的糠醛渣同步糖化发酵的乙醇得率低于未处理的糠醛渣，这与未洗糠醛渣残留的5.5%游离葡萄糖有关。糠醛渣直接同步糖化发酵所产生的副产物远高于水洗糠醛渣，添加无患子皂素表面活性剂可以有效减少副反应的发生。

3.3 糠醛渣SSF生产乙醇过程中纤维素酶用量由6%提高至12%时，乙醇得率也由58.4%提高至93.1%，说明糠醛渣中木质素对纤维素酶有较大程度的无效吸附。

[1]梁蒙.生物质能源开发利用概述[J].科技资讯,2010(33)：131.

[2]唐勇,苏肇秦,赵丹青,等.木质纤维素生物炼制及乳酸制备研究进展[J].绿色科技,2011(01)：169-173.

[3]王素芬,苏东海,周凌云.废物糠醛渣的农业利用研究进展[J].河北农业科学,2009,13(11)：97-99.

[4]孙亚东,孙冉,蒋建新,等.糠醛渣纤维乙醇同步糖化发酵过程研究[J].现代化工,2008,28(12)：48-52.

[5]孙冉,蒋建新,孙亚东,等.糠醛渣酶解工艺优化及过程的研究[J].林产工业,2011,38(1)：35-39.

[6]孙亚东,蒋建新,孙冉,等.纤维乙醇及渗透汽化原位分离技术研究进展[J].中国能源,2008,30(9)：17-21.

[7]ZHAO Dan-qing,FENG Yue,ZHU Li-wei,et al.Effect ofβ-glucosidase and gleditsia saponin on enzymatic hydrolysis pocess of furfural residues[J].Advanced Materials Research,2011,236：456-459.

[8]苏东海,孙君社.提高纤维素酶水解效率和降低水解成本[J].化学进展,2007,19(7)：1147-1152.

[9]TANG Yong,ZHAO Dan-qing,ZHU Li-wei,et al.Simultaneous saccharification and fermentation of furfural residues by mixed cultures of lactic acid bacteria and yeast to produce lactic acid and ethanol[J].European Food Research and Technology,2011,233(3)：489-495.

[10]TANG Yong,ZHAO Dan-qing,CRISTHIAN C,et al.Simultaneous saccharification and cofermentation of lignocellulosic residues from commercial furfural production and corn kernels using different nutrient media[J].Biotechnology for Biofuels,2011,4(1)：22.

[11]KANG H W,KIM Y,KIM S W,et al.Cellulosic ethanol production on temperature-shift simultaneous saccharification and fermentation using the thermos Table yeastKluyveromycesmarxianusCHY1612[J].Bioprocess and Biosystems Engineering,2012,35(1/2)：115-122.

[12]高玉霞,卜令习,邢杨,等.碱预处理糠醛渣性质及其纤维素酶解研究[J].生物质化学工程,2011,45(6)：24-30.

[13] HUANG Xiao-lin,PENNER M H.Apparent substrate inhibition of the trichoderma reesei cellulase system[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1991,39(11)：2096-2100.

[14]RIBÉREAU-GAYON P,GLORIES Y,MAUJEAN A,et al.Handbook of Enology.The Chemistry of Wine and Stabilisation and Treatments： vol.2[M].2nded. Chichester：Wiley,2000.

[15] 孜力汗,刘晨光,王娜,等.多种通气策略下的高浓度乙醇生产[J].中国生物工程杂志,2013,33(6)：86-92.

计量标准器具 竭诚欢迎使用检定

松香色度标准块

本产品具有国内行业中质量检验的权威性 长期、周到的售后服务让客户无后顾之忧

松香色度标准装置(又名《松香颜色分级标准》玻璃比色块)，是符合我国松香光学特性具有完整体系的松香颜色分级标准。1982年荣获林业部科技成果二等奖。1987年至今，被《脂松香》、《松香试验方法》国家标准所采用，并多次经国家质量监督检验检疫总局复查考核合格。

Comparative Study on Conversion Process of Furfural Residue for Ethanol Production by Simultaneous Saccharification and Fermentation

JI Li1, WANG Yong-miao1, TANG Yong1, LIU Zhi-ping2, JIANG Jian-xin1

(1.MOE Engineering Research Center of Forestry Biomass Materials and Bioenergy,Beijing Forestry University,Beijing 100083, China； 2.Hebei Chunlei Industrial Group Co.Ltd., Xingtai 054001, China)

Furfural residues and washed furfural residues were fermented to produce ethanol by simultaneous saccharification and fermentation (SSF). The combination factors (substrate mass fraction, dosage of cellulase, yeast andSapindussaponin) which affected the concentrations of ethanol and byproduct were optimized by the experiment. The yield of ethanol could reach 93.1% of the theoretical yield during SSF under the conditions of 10% substrate concentration of unwashed furfural residue, 12% cellulase, 0.5 g/LSapindussaponin and 7 g/L inoculum solution. The glucose of furfural residues (5.5%) were partly converted to ethanol compared with washed furfural residues. The byproducts (lactic acid, glycerol and acetic acid) concentrations of washed furfural residue in SSF were lower than those of unwashed furfural residue. And the addition ofSapindussaponin could inhibit the produce of byproducts.

furfural residue; simultaneous saccharification and fermentation; ethanol;Sapindussaponin; byproduct

联系地址:210042 南京市锁金五村16号中国林科院林产化学工业研究所电 话:(025)85482449,85482533联系人:谭卫红传 真:(025)85482450

10.3969/j.issn.1673-5854.2015.06.002

2015- 06- 15

国家林业局重点项目(2012- 03)；国际科技合作专项(2014DFG32550)

吉 骊(1991—)，女，甘肃兰州人，硕士生，主要从事生物乙醇方面的研究；E-mail:bjfu090524116@163.com

*通讯作者：蒋建新，男，教授，博士，博士生导师，主要从事林产化工及生物质能源方面的研究;E-mail:jiangjx@bjfu.edu.cn。

TQ35

A

1673-5854(2015)06- 0006- 05