木醋液体外抗氧化活性评价

段晓玲， 王海英， 刘志明， 冯 晨， 余森海

(1.东北林业大学 林学院，黑龙江 哈尔滨 150040； 2.东北林业大学 材料科学与工程学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

·研究报告——生物质活性成分·

木醋液体外抗氧化活性评价

段晓玲1， 王海英1*， 刘志明2， 冯 晨1， 余森海2

(1.东北林业大学 林学院，黑龙江 哈尔滨 150040； 2.东北林业大学 材料科学与工程学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

对比了白桦、杂木、木屑以及蒸馏木屑4种木醋液的还原能力，二苯基苦基肼自由基(DPPH·)的清除能力和羟基自由基(·OH)的清除能力。结果表明，4种木醋液有较强的还原能力，其中还原能力最强的是木屑木醋液，半数有效浓度(EC50)为(1.73±0.06)g/L；4种木醋液可有效清除DPPH·，木屑木醋液清除效果最佳，半数抑制浓度(IC50)为(0.20±0.01)g/L；4种木醋液的·OH清除能力相对较弱，除木屑木醋液IC50为(9.69±0.20)g/L外，其他3种木醋液清除率均未达到50%。

木醋液；抗氧化；还原能力；自由基清除能力

生物质原料通过热解可以转化为高附加值的炭、生物油和可燃气[1]，其中生物油中木醋液含酸、醇、酚、酯、羰基类及呋喃类等约500种有机成分[2]，有机成分中酚类是作用较强的天然抗氧化物质[3]。木醋液最初是在日本发现并发展起来的，木醋液精制后可用作抗氧化剂[4]、杀虫剂[5]和抑菌剂[6]等，印度用木醋液来抑制艾滋病毒复制和病毒引起的细胞病变效应，马来西亚则将木醋液用作灭菌剂、除臭剂、肥料等等，植物醋液的研究主要集中在成分分析、抑菌活性等领域[7]，关于木醋液抗氧化活性的研究目前还较少报道[8-9]。常用的化学合成抗氧化剂如2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、2-叔丁基对苯二酚(TBHQ)等，虽抗氧化性能较佳但却有一定的毒副作用，随着人们的营养和安全意识的逐渐提高，天然无副作用抗氧化剂的开发越来越引起研究人员的重视[10-11]。在本课题组前期对木醋液的成分及其对植物生长调节研究的基础上[12-13]，本研究对白桦、杂木、木屑以及蒸馏木屑4种木醋液的还原能力、二苯基苦基肼自由基(DPPH·)的清除能力和羟基自由基(·OH)的清除能力进行了对比，以此评价木醋液的抗氧化活性，以期为天然抗氧化剂的开发提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

白桦木醋液(BWV)按文献[13]制备后备用。杂木(蒙古栎、白桦、水曲柳、榆树)木醋液(MWV)，炭窑法烧制收集，通过硅藻土吸附，加速木醋液原液快速沉降，过滤，再经臭氧发生器处理30 min脱色后得到。木屑(松木屑)木醋液(SWV)，干馏釜干馏法制备收集，经制取后静置处理得到。蒸馏木屑(松木屑)木醋液(DWV)，由SWV蒸馏处理得到。

没食子酸、福林酚试剂、碳酸钠、邻苯二甲酸氢钾、氢氧化钠、铁氰化钾、三氯化铁、三氯乙酸、二苯基苦基肼自由基(DPPH·)、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸亚铁、抗坏血酸(Vc)、水杨酸，均为分析纯。

722型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司。

1.2 木醋液酚、酸类物质含量测定

参照国标GB/T 8313—2008，采用福林酚(Folin-Ciocalteu)试剂比色法测定总酚含量。以没食子酸为标样，将没食子酸配制成1 000 mg/L的标准液，分别吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL没食子酸标准液并定容至100 mL，配制成质量浓度为10、20、30、40、50 mg/L的标准溶液。精确吸取没食子酸标准溶液、水、待测样液各1.0 mL分别于刻度试管中，加入5.0 mL质量分数为10%的Folin-Ciocalteu试剂，摇匀。反应3～8 min，加入质量分数为7.5%的Na2CO3溶液4.0 mL，定容至10.0 mL，室温下放置60 min，在765 nm波长处测其吸光度。绘制吸光度与没食子酸质量浓度的标准曲线，拟合线性回归方程并计算木醋液总酚含量。木醋液总酸含量参照文献[14]采用酸碱滴定法测定。

1.3 抗氧化试验

1.3.1 还原能力测定 在众多抗氧化机制中，还原能力是一个重要的指标，其强弱反映内源性抗氧化活性的变化，其测定原理是：还原性物质将K3Fe(CN)6还原，再和Fe3+形成普鲁士蓝[Fe4(Fe(CN)6)]，根据普鲁士蓝生成量作为还原能力大小的指标[15]。普鲁士蓝在700 nm处有吸收峰，且存在定量关系，颜色越深，吸光度越大，还原能力越强。参考文献[16]的方法，取1 mL不同浓度的样液于试管中，依次加入2.5 mL的 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH值 6.6)和2.5 mL的质量分数1% K3Fe(CN)6溶液，混匀后于50 ℃水浴保温20 min后，快速冷却，再加入2.5 mL的质量分数10%三氯乙酸，离心10 min，取上清液2.5 mL，依次加入2.5 mL蒸馏水、0.5 mL的质量分数0.1%三氯化铁，充分混匀，在700 nm下测其吸光度(以蒸馏水作空白调零)。每个浓度平行操作3次，取平均值。

1.3.2 DPPH·清除率测定 二苯基苦基肼自由基(DPPH·) 是一种稳定的自由基，含有3个苯环和1个含孤对电子的氮原子[17]。DPPH·乙醇溶液为紫色，当自由基清除剂与其单个电子配对时，溶液颜色会随着自由基浓度降低而变浅，褪色程度与配对电子的数量呈化学计量关系，所以可以用吸光值的降低来判断供试样品对 DPPH·的清除率[18]。参考文献[19]的方法，分别移取1.0 mL不同浓度的样液于试管中，加入3.0 mL的0.1 mmol/L DPPH·溶液，立即混匀，室温放置15 min，测定517 nm的吸光度(Ai)，同时测定1.0 mL样液加入3.0 mL无水乙醇的吸光度(Aj)及1.0 mL无水乙醇加入3.0 mL的DPPH·溶液的吸光度(A0)。实验以1.0 mL蒸馏水和3.0 mL无水乙醇混合液作参比。每个浓度平行操作3次，取平均值。根据以下公式计算试样对DPPH·清除率(RDPPH·)：

1.3.3 ·OH清除率测定 Fenton反应中，检测木醋液对羟基自由基(·OH)的清除作用，过氧化氢和铁离子混合产生羟基自由基，在体系内加入水杨酸产生有色物质，该物质在510 nm波长处有最大吸收波长[20]。参考文献[21]的方法，向试管中依次加入1 mmol/L的FeSO4溶液1.0 mL、不同浓度的样液1.0 mL、1 mmol/L的H2O21.0 mL、3 mmol/L的水杨酸溶液2.0 mL，混匀，室温下放置30 min，于510 nm处测定吸光度(Ai′)，用蒸馏水代替水杨酸测定吸光度(Aj′)，用蒸馏水代替样液测定吸光度(A0′)。每个浓度平行操作3次，取平均值。根据以下公式计算试样对·OH清除率(R·OH)：

1.4 数据分析与处理

采用Excel 2007、SPSS19.0软件进行数据统计分析、处理，数据都以均数±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 醋液酚、酸类物质含量测定

酚类物质是结构复杂、种类繁多并且生理功能具有多样性的植物次生代谢产物，通过GC-MS分析

表1 木醋液酚、酸类物质含量比较

1)同列不同小写字母表示差异显著，下表同different lowercase letters in the same column indicated significant difference，similar in the following table

木醋液成分，证明其中酚类和有机酸类化合物含量达到总有机物的70%，且木醋液中酚、酸类物质具有显著体外抗氧化活性[22-23]。按照1.2节的方法制作标准曲线，得到木醋液中总酚质量浓度的回归方程为y=0.011 8x-0.008 4(R2=0.999 5)，由回归方程可计算出总酚质量浓度(见表1)。4种木醋液中酸类物质含量亦列入表1。

由表1可知，木醋液中总酚、总酸物质含量会随着制备材料种类以及制取后的处理方法而变化。4种木醋液酚、酸类物质含量均差异显著，具有统计学意义。杂木木醋液、木屑木醋液、蒸馏木屑木醋液3种木醋液中酚、酸类物质含量较高，其中木屑木醋液总酚含量最高。由表1还可看出，木屑木醋液和蒸馏木屑木醋液总酚含量相差较多，可能是由于在蒸馏的过程中，在除掉焦油的同时也损耗了酚类等有机成分。

图1 木醋液的还原力

2.2 抗氧化试验结果

2.2.1 还原能力 4种木醋液还原能力测定结果见图1。由图1可以看出，4种木醋液都有一定的还原能力，但不同的木醋液还原能力不同，杂木木醋液、木屑木醋液及蒸馏木屑木醋液3种木醋液的还原能力更强，白桦木醋液还原能力相对较弱。木醋液的还原能力与浓度之间呈现出显著的相关性，拟合线性方程如表2所示，相关系数R2分别为0.957 4、 0.982 4、 0.965 9、 0.933 3。BWV在质量浓度为180 g/L时，吸光度仅能达到0.350，浓度升高时吸光度随之下降；MWV质量浓度在3～30 g/L的范围内，吸光度可达到0.886；SWV质量浓度在0.4～4 g/L的范围内，吸光度可达到0.952；DWV质量浓度在20～200 g/L 范围内时，还原能力随着浓度升高逐渐增强，质量浓度为200 g/L时，吸光度可达到0.968。从半数有效浓度(EC50)角度看，BWV吸光度达不到0.5，而MWV、SWV及DWV的EC50分别为(15.25±0.22)、(1.73±0.06)和(59.62±4.01)g/L(表3)，前期研究得到抗坏血酸的EC50值为0.057 g/L[24]，由此看出相对于抗坏血酸来说，木醋液的还原能力还是相对较弱。

表2 木醋液的还原能力线性方程

2.2.2 DPPH·清除率 4种木醋液的 DPPH·清除率见图2。由图2可知，4种木醋液对 DPPH·均有较好的清除能力，且在木醋液浓度较低时，清除率随着木醋液浓度的升高而迅速增强，有较好的量效关系；当浓度升高至一定程度后，清除率曲线逐渐趋于平缓。质量浓度在7～70 g/L的范围内，BWV对DPPH·的清除率最高达94.34%；质量浓度在0.5～5 g/L范围内，MWV的清除率最高达93.92%；质量浓度在0.1～1 g/L的范围内，SWV的清除率最高达到93.52%；质量浓度在10～100 g/L的范围内，DWV的清除率最高达到89.74%。由此可以看出4种木醋液对 DPPH·有很强的清除能力。从IC50角度来评价，BWV、 MWV、 SWV和DWV 4种木醋液清除DPPH·的 IC50分别为(25.48±1.09)、(1.22±0.06)、(0.20±0.01)和(13.63±1.23)g/L(表3)，SWV的IC50值明显低于其他样品。前期研究得出抗坏血酸半数抑制浓度(IC50)为0.02 g/L[24]，SWV的IC50值稍高于抗坏血酸，即SWV的DPPH· 清除能力低于抗坏血酸。

2.2.3 ·OH清除率 4种木醋液的·OH清除率见图3。

图2 木醋液的 DPPH·清除率 图3 木醋液的羟自由基清除率

由图3可知，4种木醋液对·OH均有一定的清除作用，且清除作用对木醋液浓度有依赖关系。质量浓度在2～20 g/L范围内，SWV对·OH的清除率最高达到59.87%，随着浓度升高清除作用不再增强。从IC50角度来看，BWV、MWV和DWV这3种木醋液对·OH清除率最高达不到50%，而SWV的·OH IC50为(9.69±0.20)g/L(表3)，抗坏血酸为0.1 g/L[24]，说明相对抗坏血酸来说，4种样品对·OH的清除能力相对较弱。

2.3 抗氧化活性的IC50(EC50)比较

表3为木醋液抗氧化活性的IC50(EC50)比较。

表3 木醋液抗氧化活性的IC50(EC50)比较

为了更准确地评价样品的抗氧化活性，常用自由基清除率50%时的溶液质量浓度(IC50)或吸光值为0.5时的溶液质量浓度(EC50)来比较，较低的IC50(EC50)值表示较高的自由基清除能力[25]。从表3可知，4种木醋液还原能力(EC50)差异显著(p<0.05)，SWV的EC50最低，还原力最强；清除DPPH·的IC50差异显著，SWV最低，BWV最高，SWV清除DPPH·能力最强；除SWV外，其他3种木醋液·OH清除率最高时也未达到50%。

3 结 论

3.1 实验通过对白桦木醋液(BWV)、杂木木醋液(MWV)、木屑木醋液(SWV)和蒸馏木屑木醋液(DWV)的还原能力、二苯基苦基肼自由基(DPPH·)清除力、羟基自由基(·OH)清除力的测定，得出4种木醋液均具有一定的抗氧化活性。

3.2 MWV、SWV、DWV 3种木醋液具有较强的还原能力，其中SWV的半数有效浓度(EC50)最低为1.73±0.06 g/L，BWV还原能力较弱，吸光度未达到0.5；4种木醋液均表现出较强的DPPH·清除能力，SWV清除DPPH·的IC50最低为(0.20±0.01)g/L；清除·OH的IC50为SWV(9.69±0.20)g/L，另外3种木醋液清除率未达到50%。

3.3 采用SPSS19.0软件，对木醋液酚、酸类物质含量与体外抗氧化活性各指标IC50(EC50)进行相关性分析，结果得出酚、酸类物质含量与IC50(EC50)均为负相关，酚、酸类物质含量越高，IC50(EC50)越低，说明木醋液中酚、酸类物质是重要的抗氧化物质。

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Evaluation of Antioxidant Activities of Wood Vinegarinvitro

DUAN Xiao-ling1,WANG Hai-ying1,LIU Zhi-ming2,FENG Chen1,YU Sen-hai2

(1.College of Forestry,Northeast Forestry University, Harbin 150040, China; 2.College of Material Scienceand Engineering,Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

The reducing power and the scavenging activities against phenyl picryl hydrazine radical (DPPH·) and hydroxyl radical (·OH) of birch wood vinegar(BWV), miscellaneous wood vinegar(MWV), sawdust wood vinegar(SWV), and distillated sawdust wood vinegar(DWV) were determined. The results showed that four kinds of wood vinegar had strong reducing power and the reducing power of sawdust wood vinegar was the strongest with the half effective concentration (EC50) of (1.73±0.06) g/L. Wood vinegar could effectively scavenge DPPH·, and DPPH· scavenging activity of sawdust wood vinegar was the highest with the median inhibitory concentration (IC50) of (0.20±0.01) g/L. Wood vinegar showed relatively weak ·OH scavenging ability, except the IC50of sawdust wood vinegar was (9.69±0.20) g/L, the ·OH scavenging rates of the other three kinds of wood vinegar couldn′t reach 50%.

wood vinegar;antioxidant;reducing power;radical scavenging

10.3969/j.issn.1673-5854.2015.06.005

2015- 06- 04

黑龙江省自然科学基金项目(C201411)；哈尔滨市科技创新人才项目(2014RFXXJ038)

段晓玲(1990—)，女，云南腾冲人，硕士生，主要从事植物资源开发利用研究

*通讯作者：王海英，副教授，硕士生导师，博士，主要从事植物资源化学以及木醋液、精油、纤维素等林下经济资源利用研究；E-mail:haiyingwang908@126.com。

TQ352

A

1673-5854(2015)06- 0022- 05