维生素D受体在结直肠癌中的表达及其调控机制

维生素D受体在结直肠癌中的表达及其调控机制

严婷婷任琳琳洪洁*

上海交通大学医学院附属仁济医院消化内科上海市消化疾病研究所(200001)

背景：维生素D受体(VDR)属于类固醇激素受体超家族，参与细胞增殖、分化、凋亡以及免疫应答等多种生物学过程，在多种恶性肿瘤中呈低表达。目的：探讨VDR在结直肠癌中的表达及其调控机制。方法：收集2010年2月-2012年12月上海交通大学医学院附属仁济医院收治的结直肠癌患者30例，以免疫组化法检测癌组织和相应癌旁非癌组织标本的VDR表达情况。从基因表达汇编(GEO)数据库中提取224例结直肠癌患者的临床资料，分析其癌组织VDR表达与患者临床病理特征和生存期的关系。采用组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶EZH2-siRNA或5-氮杂胞嘧啶核苷(5-AZA)处理人结肠癌细胞株HCT116和SW620，以实时PCR检测VDR表达水平，以甲基化特异性PCR(MSP)检测VDR启动子区甲基化水平。结果：结直肠癌患者癌组织VDR阳性表达率显著低于癌旁非癌组织(26.7%对70.0%，P<0.001)。结直肠癌组织VDR表达与肿瘤组织学分期、远处转移、脉管转移、淋巴结转移呈负相关(P<0.05)；VDR高表达者生存期显著长于低表达者(P=0.032)。与转染对照-siRNA相比，HCT116、SW620细胞转染EZH2-siRNA后，EZH2 mRNA表达水平和VDR启动子区甲基化水平均显著降低(P<0.05), VDR mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。5-AZA处理HCT116、SW620细胞后，VDR启动子区甲基化水平较阴性对照组显著降低(P<0.05)，VDR mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。结论：结直肠癌中VDR表达下调且与患者预后呈正相关。VDR在结直肠癌中的转录抑制受组蛋白甲基化和DNA甲基化共同调控。

关键词结直肠肿瘤；维生素D受体；组蛋白甲基化；DNA甲基化；转录调控；表观遗传

Transcriptional Regulation;Epigenetics

结直肠癌是消化系统常见恶性肿瘤之一，近年来随着诊疗水平的提高，其病死率有所降低，但癌症相关死亡率仍居全球第二位[1]。研究指出，结直肠癌发病与饮食习惯、生活方式以及遗传因素有关[2-3]。随着结直肠癌发病机制研究的深入，现已发现基因突变或缺失[4]、表观遗传异常改变[5]以及非编码RNA异常表达[6]等参与了结直肠癌的发生、发展过程。

维生素D受体(vitamin D receptor, VDR)属于类固醇激素受体超家族，是一种亲核蛋白，能介导表达维生素D的细胞产生活性成分1，25-二羟维生素D3[1,25-(OH)2-D3]，参与调节体内钙磷代谢，在细胞增殖、分化、凋亡以及免疫应答等多种生物学过程中发挥重要作用[7-10]。此外，VDR在多种恶性肿瘤，如前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌等[11-13]的发生、发展中的作用亦越来越受重视。本研究旨在观察VDR在结直肠癌中的表达及其与肿瘤临床病理特征的关系，并初步探讨结直肠癌中VDR的调控机制。

材料与方法

一、资料收集

1. 组织标本获取：收集2010年2月-2012年12月于上海交通大学医学院附属仁济医院行结直肠癌根治术患者的癌组织标本30例和相应癌旁非癌组织标本(距癌组织边缘≥15 cm)30例，其中男13例，女17例，年龄38~79岁，平均(65.37±2.12)岁。所有标本经HE染色后由组织病理学检查确诊。研究方案经上海交通大学医学院附属仁济医院医学伦理委员会批准。所有入选患者均签署知情同意书。

2. 数据库信息采集：从基因表达汇编(GEO)数据库提取GSE14333数据集中224例结直肠癌患者的临床资料，包括患者性别、年龄、肿瘤质量、肿瘤大小、TNM分期、组织学分期、有无远处转移、有无脉管转移、有无淋巴结转移、生存期等。应用生物信息学技术提取数据库中的结直肠癌组织芯片数据，采集224例结直肠癌患者的癌组织VDR表达水平，分析其表达与患者临床病理特征和生存期的关系。按VDR表达水平进行排序，224例患者中前25%(56例)定义为VDR高表达，后75%(168例)定义为低表达。

二、细胞株和主要试剂

人结肠癌细胞株HCT116、SW620购自美国ATCC细胞库，以含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基培养于37 ℃、5% CO2培养箱内。兔抗人VDR单克隆抗体购自Abcam公司。FuGENE®HD转染试剂购自Promega公司。组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶EZH2(enhancer of zeste homolog 2)-siRNA由上海吉玛制药技术有限公司设计、合成，3条siRNA序列分别为：5’-GAG GAC GGC UUC CCA AUA A-3’；5’-GCU GAA GCC UCA AUG UUU A-3’；5’-UAA CGG UGA UCA CAG GAU A-3’；对照-siRNA序列为：5’-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3’。5-氮杂胞嘧啶核苷(5-azacytidine, 5-AZA)购自Sigma公司。Trizol试剂、RNA逆转录试剂盒、实时PCR试剂盒购自Takara公司。EZ DNA 甲基化检测试剂盒购自Zymo Research公司(包括碱基转化和转化后DNA回收全套试剂，用于提取经亚硫酸氢盐修饰的基因组DNA)。

三、方法

1. 免疫组化法检测VDR表达：结直肠癌和相应癌旁非癌组织标本4%甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片，常规脱蜡复水，微波抗原修复，以3% H2O2阻断内源性过氧化物酶10 min，羊血清封闭30 min后滴加兔抗人VDR单克隆抗体(1∶200)，4 ℃过夜，HRP标记的二抗孵育0.5 h，DAB显色，苏木精复染，自来水冲洗，脱水，透明，中性树脂封片，光学显微镜下观察。

结果判定：根据阳性细胞染色强度和阳性细胞比率综合判断染色结果。阳性细胞染色强度分数：0分，无染色；1分，淡黄色；2分，棕黄色；3分，棕褐色。阳性细胞比率分数：0分，0%~5%；1分，6%~25%；2分，26%~50%；3分，51%~75%；4分，>75%。阳性标记分数=阳性细胞染色强度分数×阳性细胞比率分数：0分为阴性，1~3分为弱阳性，4~6分为中强阳性，>6分为强阳性。评分由2名高年资病理医师独立完成。

2. 人结肠癌细胞转染EZH2-siRNA：取对数生长期HCT116和SW620细胞，经胰酶消化后，以3×105个/孔接种于6孔板，待细胞密度达30%~50%后，将3条EZH2-siRNA和对照-siRNA以FuGENE®HD转染试剂分别转染至细胞内，具体步骤参照试剂说明书，培养4~6 h后吸出转染液，每孔加入2 mL 完全培养基，48 h后收集细胞。选取3条EZH2-siRNA中抑制率最高者进行后续实验。

3. 5-AZA处理人结肠癌细胞：取对数生长期HCT116和SW620细胞，以20%~30%的密度接种于6孔板，处理组每孔加入50 nmol 5-AZA，阴性对照组加入等体积DMSO，72 h后收集细胞。

4. 细胞RNA提取：取经上述步骤2、3处理后的HCT116和SW620细胞，PBS洗涤后加入Trizol试剂裂解细胞，收集裂解液后加入氯仿200 μL，剧烈震荡15 s，12 000×g离心15 min，将上清液移至另一离心管中，异丙醇等体积沉淀，75%乙醇洗涤、空气干燥后，以适量DEPC水溶解。

5. 实时PCR检测EZH2、VDR mRNA表达：取上述步骤4获得的RNA逆转录为cDNA，行实时 PCR检测。EZH2引物上游：5’-TAC TTG TGG AGC CGC TGA C-3’, 下游：5’-CTG CCA CGT CAG ATG GTG-3’；VDR引物上游： 5’-CCC TTG GGT GAG ATT-3’，下游：5’-CTC CGC ACG AAT GG-3’。PCR反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。以2-△△Ct法分析目的基因相对表达量。

6. 甲基化特异性PCR(MSP)检测VDR启动子区甲基化水平：取经上述步骤2、3处理后的HCT116和SW620细胞，采用EZ DNA 甲基化检测试剂盒，对细胞DNA进行亚硫酸氢钠修饰，提取并纯化修饰后的DNA，采用VDR-MSP引物行PCR扩增。VDR-MSP引物上游：5’-GTG GAC ATC GGC ATG ATG AAG-3’，下游：5’-GGT CGT AGG TCT TAT GGT GGG-3’。PCR反应条件同步骤5。

四、统计学分析

结果

一、VDR在结直肠癌和癌旁非癌组织中的表达

VDR免疫组化染色阳性物质主要表达于细胞核(图1)。30例结直肠癌组织中8例(26.7%)VDR表达阳性，但无强阳性表达；30例癌旁非癌组织中21例(70.0%)VDR表达阳性，其中10例(33.3%)为强阳性表达。两组间VDR阳性表达率差异有统计学意义(χ2=11.279，P=0.000 8)。

A：结直肠癌组织；B：癌旁非癌组织

二、结直肠癌组织VDR表达与患者临床病理特征和生存期的关系

对提取自GSE14333数据集224例结直肠癌患者临床资料的分析显示，结直肠癌组织VDR表达与患者性别、年龄、肿瘤质量、肿瘤大小、TNM分期无关(P>0.05)，而与组织学分期、远处转移、脉管转移、淋巴结转移呈负相关(P<0.05)(表1)。生存分析发现，VDR高表达组生存期显著长于低表达组(P=0.032)(图2)，表明结直肠癌组织中的VDR表达与患者预后较好相关，可作为预后判断指标。

三、组蛋白甲基化参与结直肠癌VDR表达调控

与转染对照-siRNA相比，HCT116、SW620细胞转染EZH2-siRNA后，EZH2 mRNA表达水平显著降低(P<0.001)(图3A)，VDR启动子区甲基化水平显著降低(P<0.05)(图3B)，VDR mRNA表达水平显著升高(P<0.05)(图3C)，提示结直肠癌组织中的VDR表达受组蛋白甲基化调控。

表1结直肠癌组织VDR表达与患者临床病理特征的关系n(%)

临床病理特征例数VDR低表达(n=168)VDR高表达(n=56)P值性别 男11788(75.2)29(24.8)0.9384 女10780(74.8)27(25.2)年龄(岁) ≤557454(73.0)20(27.0)0.7855 >55150114(76.0)36(24.0)肿瘤质量(g) ≤1004833(68.8)15(31.2)0.8342 >1003122(71.0)9(29.0)肿瘤大小(cm3) ≤303724(64.9)13(35.1)0.0964 >303428(82.4)6(17.6)TNM分期 T195(55.6)4(44.4)0.2980 T24638(82.6)8(17.4) T3150112(74.7)38(25.3) T41913(68.4)6(31.6)组织学分期 Ⅰ,Ⅰ-Ⅱ,Ⅱ146102(69.9)44(30.1)0.0151 Ⅱ-Ⅲ,Ⅲ7866(84.6)12(15.4)远处转移 M0168120(71.4)48(28.6)0.0360 M14035(87.5)5(12.5)脉管转移 M0162116(71.6)46(28.4)0.0055 M15852(89.7)6(10.3)淋巴结转移 无9566(69.5)29(30.5)0.0251 有11595(82.6)20(17.4)

图2结直肠癌组织VDR高表达组与低表达组Kaplan-Meier生存曲线

四、DNA甲基化参与结直肠癌VDR表达调控

5-AZA处理HCT116、SW620细胞后，VDR启动子区甲基化水平较阴性对照组显著降低(P<0.05)(图4A)，VDR mRNA表达水平显著升高(P<0.05)(图4B)，提示结直肠癌组织中的VDR表达受DNA甲基化调控。

讨论

近年来，有关表观遗传与结直肠癌发生、发展关系的研究越来越多，表观遗传是指在不改变DNA序列的前提下，通过某些机制引起可遗传基因表达或细胞表型变化，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、RNA干扰、基因组印记等。随着相关研究的开展，人们逐渐认识到表观遗传与肿瘤的发生、发展存在密切联系。目前已有大量关于VDR与肿瘤发生机制的研究[11-13]，发现VDR在多种恶性肿瘤中呈低表达，且与肿瘤侵袭能力相关，但其表达调控机制尚未完全明确。本研究发现，VDR在结直肠癌组织中表达明显下调，且与肿瘤组织学分期、远处转移、脉管转移、淋巴结转移呈负相关，与患者预后呈正相关，提示VDR在结直肠癌的发生、发展中发挥抑癌基因的作用。

组蛋白甲基化是一种常见的基因表达表观调节方式，大量研究[14-15]表明组蛋白异常甲基化与肿瘤发生有关。EZH2是果蝇zeste基因增强子的人类同源基因，具有组蛋白甲基转移酶活性，是多梳蛋白的重要组分。EZH2可通过使组蛋白甲基化而抑制多种抑癌基因表达，导致肿瘤发生[16]，如Cao等[17]的研究发现，EZH2可使组蛋白H3K27位点发生甲基化，介导抑癌基因E-钙黏蛋白(E-cadherin，

A：EZH2 mRNA表达水平；B：VDR启动子区甲基化水平；C：VDR mRNA表达水平

A：VDR启动子区甲基化水平；B：VDR mRNA表达水平

E-cad)转录沉默。VDR与E-cad同属于上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)标记物。本研究以EZH2-siRNA下调人结肠癌细胞EZH2表达后，VDR mRNA表达水平显著升高，此结果与Lin等[18]的研究结果均证实，EZH2可通过改变VDR组蛋白甲基化水平介导VDR转录失活，从而导致结直肠癌的发生、发展。

DNA甲基化是一种经典的表观修饰调节方式。70%的基因启动子区位于CpG岛[19]，研究[20]显示特定基因编码区上游的CpG岛甲基化后，转录因子及其协同因子将不能紧密结合至启动子区，可引起该基因转录失活，从而导致肿瘤发生。本研究发现，采用5-AZA抑制人结肠癌细胞DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, DNMTs)后，VDR启动子区甲基化水平降低，VDR mRNA表达水平显著升高，提示DNA甲基化与结直肠癌VDR低表达相关。

虽然组蛋白甲基化和DNA甲基化均参与了结直肠癌VDR的表达调控，但这两种调控机制间是否存在内在联系仍有待进一步研究。有研究报道，发生组蛋白H3K27三甲基化的基因更易发生DNA甲基化[21]；EZH2能与DNMTs直接结合，从而启动并维持相应靶基因(VDR等)DNA的甲基化状态[22]。但亦有研究[23]表明，EZH2仅能募集DNMTs，并不能启动DNA甲基化。本研究发现，下调人结肠癌细胞EZH2表达后，VDR启动子区甲基化水平明显降低，因此认为结直肠癌中EZH2介导的VDR低表达状态部分是由DNA甲基化所致，而EZH2介导的组蛋白甲基化是否可进一步促进DNA甲基化的发生，抑或VDR启动子区DNA甲基化独立于EZH2介导的组蛋白甲基化，有待进一步研究。

综上所述，结直肠癌中VDR表达下调且与肿瘤发生、发展以及患者预后相关，其在结直肠癌中的转录抑制受组蛋白甲基化和DNA甲基化共同调控，对其作进一步的深入研究将有助于临床实践中结直肠癌的诊治和预后评估。

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(2014-10-22收稿；2014-12-08修回)

Expression and Regulation Mechanism of Vitamin D Receptor in Colorectal CancerYANTingting,RENLinlin,HONGJie.DivisionofGastroenterologyandHepatology,RenJiHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaoTongUniversity;ShanghaiInstituteofDigestiveDisease,Shanghai(200001)

Correspondence to: HONG Jie, Email: jiehong97@163.com

Background: Vitamin D receptor (VDR) is a member of the steroid hormone receptor superfamily, which plays roles in various biological processes including cell proliferation, differentiation, apoptosis and immune responses, and is low expressed in many malignant tumors. Aims: To evaluate the expression and regulation mechanism of VDR in colorectal cancer. Methods: A total of 30 patients with colorectal cancer admitted from February 2010 to December 2012 at Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University were enrolled. Expression of VDR in cancerous tissue and para-cancer noncancerous tissue was determined by immunohistochemistry. Clinical data of 224 patients with colorectal cancer were collected from Gene Expression Omnibus (GEO) for analyzing the correlation between VDR expression in cancerous tissue and clinicopathological characteristics as well as survival time. Expression of VDR in human colon cancer cell lines HCT116 and SW620 transfected with enhancer of zeste homolog 2 (EZH2)-siRNA or treated with 5-azacytidine (5-AZA) was determined by real-time PCR, and methylation level of VDR promoter was determined by methylation-specific PCR (MSP). Results: Positivity rate of VDR was significantly lower in colorectal cancer tissue than that in para-cancer noncancerous tissue (26.7%vs. 70.0%,P<0.001). Expression of VDR was negatively correlated with histological staging, distant metastasis, vascular metastasis and lymph node metastasis of colorectal cancer (P<0.05). Survival time was significantly longer in patients with high expression of VDR than patients with low expression of VDR (P=0.032). Compared with cells transfected with control-siRNA, expression of EZH2 mRNA and methylation level of VDR promoter in HCT116 and SW620 cells transfected with EZH2-siRNA were significantly decreased (P<0.05), and expression of VDR mRNA was significantly increased (P<0.05). Compared with negative control group, methylation level of VDR promoter in HCT116 and SW620 cells treated with 5-AZA was significantly decreased (P<0.05), and expression of VDR mRNA was significantly increased (P<0.05). Conclusions: Expression of VDR in colorectal cancer is down-regulated and positively correlated with a favourable prognosis. Transcriptional repression of VDR in colorectal cancer is co-regulated by histone methylation and DNA methylation.

Key wordsColorectal Neoplasms;Vitamin D Receptor;Histone Methylation;DNA Methylation;

通信作者*本文, Email： jiehong97@163.com

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.04.002