响应曲面法优选粪箕笃总皂苷的提取工艺

杨安平，柯俊东

(1.佛山科学技术学院，佛山 528000；2.广东医学院，东莞 523808)



响应曲面法优选粪箕笃总皂苷的提取工艺

杨安平1，柯俊东2

(1.佛山科学技术学院，佛山 528000；2.广东医学院，东莞 523808)

目的：利用响应面法优化粪箕笃总皂苷的提取工艺条件。方法：以提取温度、液料比、乙醇浓度及提取时间为影响因子，应用Box-Behnken中心组合设计建立数学模型，以提取粪箕笃总皂苷的提取率作为响应值，进行响应面法分析。结果：粪箕笃总皂苷提取的最佳工艺为：提取温度:90 ℃，液料比25∶1，乙醇浓度40%，提取时间100 min，理论提取率19.59%，实际测得值为18.80%，两者较接近。结论：Box-Behnken设计结合响应面分析法可以用于粪箕笃总皂苷提取工艺的优化。

粪箕笃，皂苷，响应面法

粪箕笃为防己科多年生的草本植物粪箕笃(StephanialongaLour)的全草或根茎及根，产于我国南部，主要分布于广东、广西等地，为岭南地区特有药材，具有清热解毒、利湿消肿、祛风活络之功效，用于热病发狂、泄泻、痢疾、小便淋涩、水肿、黄疸、风湿痹痛、喉痹、疮痈肿毒、毒蛇咬伤[1]。杨淑君等[2]采用皮下注射丙酸睾酮制作前列腺增生小鼠模型，观察粪箕笃乙醇提取物的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等各萃取物对前列腺增生小鼠的前列腺湿重、前列腺体积与前列腺指数的影响，结果显示粪箕笃乙醇提取物的氯仿萃取物可明显降低前列腺增生小鼠的前列腺湿重、前列腺体积和前列腺指数。经化学鉴别粪箕笃乙醇提取物的氯仿萃取物为皂苷类成分，本实验以粪箕笃总皂苷提取率为指标，应用响应面法对粪箕笃总皂苷的提取工艺条件进行优化，得到粪箕笃总皂苷的最佳提取工艺，为粪箕笃皂苷分离纯化与开发应用提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 紫外可见分光光度计(北京凯奥科技发展有限公司，型号：k5600)，超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ3200B)，TC-15套恒温器(海宁市新华医疗器械厂)，HH-4数显恒温水浴锅(常州奥华仪器有限公司)，旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂，型号：RE52CS-1)，低温冷却循环泵(巩义市予华仪器有限责任公司，型号：DLSB5L/20)，循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司，型号：SHZ-DШ)。

1.2 试药 粪箕笃(采集于广西，经广西中医药大学李勇华教授鉴定为真品)，人参皂苷Rg 1标准品(中国食品药品检定研究院，批号U5CY-4Q30)，香草醛、高氯酸、冰醋酸、 石油醚、无水乙醇、甲醇均为市售分析纯。

2 方法与结果

2.1 粪箕笃总皂苷的提取方法 将粪箕笃药材粉碎，称取粪箕笃粉100.0 g，加300 ml石油醚脱脂、脱色提取30 min，过滤，滤液回收石油醚，滤渣在一定温度、液料比、乙醇浓度等条件下提取一定时间，过滤，将滤液减压浓缩干燥得粪箕笃提取物。

2.2 粪箕笃总皂苷的定性分析

2.2.1 泡沫反应 取粪箕笃提取物0.01 g，置于试管中，加蒸馏水5 ml，强力振摇1 min，试管内产生大量泡沫，15 min后消失，结果显示粪箕笃提取物含有皂苷类化合物。

2.2.2 醋酐-浓硫酸反应(liebermann-burchard) 取少量粪箕笃提取物置于试管中，加醋酐超声溶解，加浓硫酸-醋酐试剂，观察到试管内颜色变化：淡黄色变成黄棕色，颜色变深，并产生热量，结果显示粪箕笃皂苷类化合物为三萜皂苷类化合物。

2.2.3 三氯醋酸反应(rosen-heimer) 取少量粪箕笃提取物置于试管中，加水超声溶解，滴在滤纸上，喷洒三氯醋酸试剂，分别在60和100 ℃观察其颜色变化。结果显示60 ℃时无任何明显变化，100 ℃时颜色变为紫色，进一步说明粪箕笃皂苷类化合物为三萜皂苷类化合物。

2.3 粪箕笃总皂苷含量测定(香草醛-高氯酸法)

2.3.1 最大波长的确定 精密称取干燥至恒重的人参皂苷Rg 1对照品5.0 mg，加甲醇超声溶解，定容至10 ml，摇匀，作为对照品溶液。精密吸取对照品溶液0.2 ml置于试管中，水浴加热除去溶剂，加入新配制的5%香草醛-冰乙酸溶液0.2 ml、高氯酸0.8 ml，摇匀，溶液呈玫瑰红色后，在60 ℃水浴中加热15 min，流水冷却，加冰乙酸5 ml，摇匀，放置20 min，在480～800 nm下扫描，确定最大吸收波长。结果显示人参皂苷Rg 1的在可见光区域内最大吸收波长为555 nm。

2.3.2 标准曲线的绘制 精密称取干燥至恒重的人参皂苷Rg 1对照品5.0 mg，加甲醇超声溶解，定容至10 ml，摇匀，作为备用液，分别精密吸取对照品溶液125、150、200、250、300和350 μl于10 ml试管中，水浴加热除去溶剂，加入新配制的5%香草醛-冰乙酸溶液0.2 ml、高氯酸0.8 ml，摇匀，溶液呈玫瑰红色，在60 ℃水浴中加热15 min，流水冷却，加冰乙酸5 ml，摇匀，放置20 min，在555 nm处测定吸光度，甲醇溶液作空白对照。以人参皂苷Rg 1浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，以浓度对吸光度进行回归，计算回归方程为A=20.098C+0.005 3(R2=0.999 2)。人参皂苷Rg 1在0.010 42～0.0291 7 mg/ml范围内，呈现良好的线性关系。

2.3.3 精密度考查 取同一供试品溶液，按“2.3.1”项下方法操作，连续测定 6 次，计算 RSD 为1.21%，说明仪器精密度符合要求。

2.3.4 重复性考查 精密称取 6 份粪箕笃粉末，按“2.1”项下方法进行提取，按“2.3.1”项下方法测定吸光度，计算RSD为1.22%，说明本试验方法重复性符合要求。

2.3.5 稳定性考查 取同一供试品溶液，按“2.3.1”项下步骤，分别在 0、5、10、30、60和120 min 各测定一次，得出总皂苷吸光度，计算其RSD为1.64%，该样品溶液在 120 min 内稳定。

2.3.6 加样回收率试验 取已知总皂苷含量的粪箕笃粉末6 份，分别加入Rg 1对照品约 0.1 mg，按“2.1”项下方法进行提取，按“2.3.1”项下方法测定吸光度，测定各供试品溶液的吸光度值，按照公式[回收率(%)=(加标样品实测值-样品测定值)/加入对照品量×100%]计算，平均回收率为98.09%，RSD值为2.30%，显示该试验方法的准确度符合要求。

2.3.7 总皂苷含量测定 准确称取粪箕笃总皂苷样品130 mg溶解于20 ml量瓶中，加甲醇超声溶解，定容，准确吸取0.2 ml置于试管中，其余步骤同“2.3.1”。

2.3.8 总皂苷含量的计算 总皂苷(%)=(测得粪箕笃皂苷的量÷称取的粪箕笃粉量)×100%。

2.4 单因素试验 选择提取温度、液料比、乙醇浓度、提取时间等因素考查对粪箕笃总皂苷提取率的影响，以确定相关因素及其范围。

2.4.1 提取温度对提取率的影响 称取粪箕笃粉末100.0 g 5份，分别加300 ml石油醚脱脂、脱色提取30 min，过滤，滤液回收石油醚，滤渣在固定液料比10∶1，提取溶剂为70%乙醇，分别在50、60、70、80和90 ℃条件下提取30 min，过滤，将滤液减压浓缩干燥得粪箕笃粗皂苷，并测定，考查温度对粪箕笃总皂苷提取率的影响。结果见图1。

图1 提取温度对粪箕笃总皂苷提取率的影响

2.4.2 液料比对提取率的影响 称取粪箕笃粉末100.0 g 5份，分别置于500 ml圆底烧瓶中，加300 ml石油醚脱脂、脱色提取30 min，过滤，滤液回收石油醚，滤渣在固定提取温度80 ℃，提取溶剂为70%乙醇，分别在液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1和30∶1条件下提取30 min，过滤，将滤液减压浓缩干燥得粪箕笃粗皂苷，并测定，考查液料比对粪箕笃总皂苷提取率的影响。结果见图2。

2.4.3 乙醇浓度对提取率的影响 称取粪箕笃粉100.0 g 5份，分别加300 ml石油醚脱脂、脱色提取30 min，过滤，滤液回收石油醚，滤渣在固定温度80 ℃，液料比为20∶1，分别在10%、30%、50%、70%和90%乙醇浓度条件下提取30 min，过滤，将滤液减压浓缩干燥得粪箕笃粗皂苷，并计算，考查乙醇浓度对粪箕笃总皂苷提取率的影响。结果见图3。

图2 液料比对粪箕笃总皂苷提取率的影响

图3 乙醇浓度对粪箕笃总皂苷提取率的影响

2.4.4 提取时间对提取率的影响 将粪箕笃粉碎，准确称取粪箕笃粉100.0 g 5份，分别加300 ml石油醚脱脂、脱色提取30 min，过滤，滤液回收石油醚，滤渣在固定温度80 ℃，液料比为20∶1，乙醇浓度为50%条件下，分别提取20、40、60、80和100 min，过滤，将滤液减压浓缩干燥得粪箕笃粗皂苷，并计算，考查提取时间对粪箕笃总皂苷提取率的影响。结果见图4。

图4 提取时间对粪箕笃总皂苷提取率的影响

2.5 响应曲面试验

2.5.1 试验设计 参考文献的方法[3-5]，根据 Box-Behnken 中心组合试验设计原理，在单因素试验基础上，以提取温度(A)、液料比(B)、乙醇浓度(C)和提取时间(D)4 个因素为自变量。每个自变量的低、中、高水平分别以-1，0，1 进行编码，以粪箕笃总皂苷提取率(Y)为响应值，应用Design-Expert 7.0软件设计4因素3水平(共29个试验点5个中心点)的响应面试验，利用响应面试验结果，确定粪箕笃中总皂苷的最佳提取条件。试验因素与水平设计见表1。

2.5.2 结果与分析 以乙醇浓度(A)、液固比(B)、提取温度(C)和提取时间(D)为自变量，以粪箕笃总皂苷得率为响应值(Y)，进行响应面分析试验。试验方案及结果见表2。

表1 响应面试验因素与水平表

表2 响应面分析方案及试验结果

采用Design-expert软件对表6中数据进行多项式拟合回归，建立多元二次响应面回归模型：Y=122.175 19-1.884 12 A-4.016 37 B+0.467 52 C-0.315 49 D+4.000 00 E-003 AB+4.250 00 E-003 AC+3.750 00 E-005 AD-8.250 00 E-003 BC+0.019 350 BD-2.531 25 E-003 CD+0.010 707 A2+0.069 580 B2-5.010 63 E-003 C2+3.300 00 E-004 D2，各因素的方差分析结果见表3。

表3 粪箕笃总皂苷提取回归模型的方差分析

由表3可知，模型的Prob>F值小于0.000 1，表明二次方程拟合极显著，失拟项F值为0.073 4，表明失拟项相对于绝对误差是不显著的，而不显著的失拟项才可用。温度(A)、液料比(B)和乙醇浓度(C)的Prob>F值小于0.01，表明其对总皂苷提取率影响极显著，提取时间(D)的Prob>F值大于0.05，表明其对总皂苷提取率影响不显著，则影响粪箕笃总皂苷提取率的各因素按影响大小排序依次为提取温度>乙醇浓度>液料比>提取时间。二次项A2、B2和C2影响显著，交互项按影响大小排列依次为BD>CD>AC>BC>AC>AB>AD，其中BD达到极显著水平，AC、BC、CD也处于显著水平，其他不显著，表明各因素对皂苷提取率不是简单线性关系。各交互因素响应曲面图见图5-16。

图5 温度与液料比对提取率的等高线图

图6 温度与液料比对提取率的响应面图

图7 温度与乙醇浓度对提取率的等高线图

图8 温度与乙醇浓度对提取率的响应面图

图9 温度与提取时间对提取率的等高线图

图10 温度与提取时间对提取率的响应面图

图11 液料比与乙醇浓度对提取率的等高线图

图12 液料比与乙醇浓度对提取率的响应面图

图13 液料比与提取时间对提取率的等高线图

图14 液料比与提取时间对提取率的响应面图

图15 乙醇浓度与提取时间对提取率的等高线图

图16 乙醇浓度与提取时间对提取率的响应面图

决定系数R2=0.965 1，CV值为5.06%，说明模型拟合好，试验误差小，试验操作可信，可用此模型对粪箕笃总皂苷提取进行分析和预测。通过回归模型预测的粪箕笃总皂苷提取的最佳工艺条件为：提取温度90 ℃，液料比25∶1，乙醇浓度40%，提取时间为100 min，在此条件下，粪箕笃总皂苷得率理论上可达19.59%。采用此工艺条件进行验证实验，实际测得粪箕笃总皂苷得率为18.80%，与实际值相差不大，说明采用响应面法得到的工艺参数可靠，具有一定的实际价值。

1 广西壮族自治区食品药品监督管理局. 广西壮族自治区壮药质量标准(第二卷)[M]. 广西∶广西科学技术出版社,2011:290-291

2 杨淑君,蔡小连,杨安平. 粪箕笃治疗前列腺增生小鼠有效部位的筛选[J]. 医药前沿,2013,(25):214-215

3 高义霞,景红艳,姜祖君,等. 响应面分析法优化乳苣总黄酮提取工艺的研究[J]. 中药材2010,33(4):621-624

4 刘军海,黄宝旭,蒋德超. 响应面分析法优化艾叶多糖提取工艺研究[J]. 食品科学,2009,30(2):114-119

5 王明艳,张小杰,王涛,等. 响应面法优化香椿叶多糖的提取条件[J]. 食品科学,2010,31(4):106-111

Optimization of the extraction of total saponins fromStephaniaLongaL by response surface analysis

Yang Anping1，Ke Jundong2

(1.School of Medicine，Foshan University，Foshan 528000； 2. Guangdong Medical College，Dongguan 523808)

Objective: To optimize the extraction technology of total saponins fromStephaniaLongaL.by response surface methodology (RSM). Methods: Extraction temperature，solvent-solid ratio，ethanol concentration and extraction time were selected as influencing factors during extraction. The experiment mathematical model was arranged according to Box-Behnken central composite experiment design. Results: The optimal extraction conditions were as follows: extraction temperature : 90 ℃，solvent-solid ratio: 25∶1，ethanol concentration: 40%，and extraction time: 100 min. The predicted extraction rate of total saponins was 19.59% under the optimum conditions while the actual rate was 18.80%. Conclusion: The combination of Box-Behnken design and response surface analysis can optimize the extraction technology of total saponins fromStephaniaLongaL.

StephaniaLongaL，saponins，response surface methodology (RSM)

2015-02-27

广东省自然科学基金项目(No.S2012010010489)

R284.2

A

1006-5687(2015)02-0005-05