HPLC法测定土霉素二水物的有关物质的方法研究*

顾 云，曹晓云

(天津市药品检验所，天津 300070)



HPLC法测定土霉素二水物的有关物质的方法研究*

顾 云，曹晓云

(天津市药品检验所，天津 300070)

目的：建立HPLC法测定土霉素二水物的有关物质。方法：色谱柱为XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为醋酸铵溶液[0.25 mol/L醋酸铵溶液-0.05 mol/L乙二胺四醋酸二钠溶液-三乙胺(100∶10∶1)，用醋酸调节pH至7.5]-乙腈(88∶12)，流速：1.0 ml/min，紫外检测波长：280 nm，柱温：30 ℃，进样量：10 μl。 结果：土霉素在0.25～15 μg/ml范围内线性关系良好(r=0.999 95)，最低检出限为 0.1 μg/ml。结论：本方法专属性强、灵敏度高、准确度和重复性好、方法简便，可作为土霉素有关物质的检测方法。

HPLC，有关物质，土霉素二水物

土霉素二水物[1]属四环素类抗生素药，对革兰阴性菌和革兰阳性菌均有抑制作用，同时对立克次体、螺旋体及某些原虫等也具有抑制作用。为更好地控制土霉素二水物的质量，采用HPLC法测定土霉素二水物有关物质，该方法专属性强、灵敏度高、准确度和重复性好、方法简便，可作为土霉素有关物质的检测方法。

1 仪器与试药

LC-2010 cLass-vp型高效液相色谱仪(日本岛津公司)，AG245型电子天平，PB-10型精密pH计(塞多利斯公司)，恒温干燥箱DN64(日本Uamato)，紫外线杀菌车DZS3型(上海科凌医疗器械有限公司)。土霉素样品(河北圣雪大诚制药有限公司，批号T3-11314417-3、T3-11301416-3、T3-11319424-3)，土霉素对照品( 批号130487-200302，中国药品生物制品检定所提供，88.2%)。4-差向四环素对照品(批号130401-200209，中国药品生物制品检定所提供)。乙腈、甲醇为色谱纯，水为净化水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：醋酸铵溶液[0.25 mol/L醋酸铵溶液-0.05 mol/L乙二胺四醋酸二钠溶液-三乙胺(100∶10∶1)，用醋酸调节pH至7.5]-乙腈(88∶12)，流速：1.0 ml/min，柱温：30 ℃，紫外检测波长：280 nm，进样量：10 μl。

2.2 溶液制备

2.2.1 供试品溶液 取本品适量，用0.01 mol/L盐酸溶解并定量稀释制成每1 ml中约含0.5 mg的溶液，作为供试品溶液。

2.2.2 对照溶液 精密量取供试品溶液2 ml，置100 ml量瓶中，用0.01 mol/L盐酸溶解并定量稀释至刻度，作为对照溶液。

2.3 系统适用性试验 取4-差向四环素对照品适量，加0.01 mol/L盐酸溶解并定量稀释制成每1 ml中约含0.5 mg的溶液；取土霉素素对照品适量，加0.01 mol/L盐酸溶解并定量稀释制成每1 ml中约含0.5 mg的溶液；取上述两种溶液(1∶24)混合，作为分离度测试溶液。取该溶液10 μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按4-差向四环素峰(与土霉素色谱峰相对保留时间约为0.9)、土霉素峰、2-乙酰-2-去酰胺土霉素峰(与土霉素色谱峰相对保留时间约为1.1)的顺序出峰。4-差向四环素与土霉素峰分离度应不小于2.0，土霉素峰与2-乙酰-2-去酰胺土霉素峰的分离度应不小于2.5[2]。见图1。

2.4 专属性试验 取样品约25 mg，置50 ml量瓶中，共6份，分别按以下条件操作。①酸破坏：加1 mol/L盐酸溶液2 ml，于60 ℃水浴中加热20 min，取出，立即加1 mol/L氢氧化钠溶液调pH值至中性；②碱破坏：加1 mol/L氢氧化钠溶液2 ml，室温放置20 min，取出，立即加1 mol/L盐酸溶液调pH值至中性；③氧化破坏：加30%过氧化氢溶液0.5 ml，室温放置20 min；④加热破坏：置105 ℃烤箱中加热2 h；⑤光照破坏：强光4 000 lx照射48 h(距光源约5 cm高度)；⑥紫外光照破坏：紫外灯(254 nm)照射6 h(距光源约15 cm高度)。取上述样品依法操作，加0.01 mol/L HCl溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取10 μl注入液相色谱仪，记录色谱图(见图2)。结果表明：杂质峰之间、杂质与主峰之间均能分离良好，本方法专属性较好。

1. 4-差向四环素 2. 土霉素

2.5 最小检出限 用逐步稀释法，按信噪比3∶1计算，该方法的最小检测限为0.1 μg/ml，最小定量限为

0.2 μg/ml。

2.6 线性范围 取土霉素供试品(批号T3-11314417-3)加0.01 mol/L的盐酸溶液定量制成每1 ml中含50 μg的溶液，分别精密量取适量，加0.01 mol/L的盐酸溶液定量制成每1 ml中含0.25、2.5、5、10和15 μg的溶液。依法测定，以峰面积对浓度进行线性回归，回归方程为：Y=12 444X-494.26(r=0.999 95)，结果在0.25～15 μg/ml范围内线性关系良好。

2.7 稳定性试验 取样品测定项下供试品溶液(批号T3-11314417-3)分别于室温放置0、1、2、4、6、8和24 h后进行测定，结果RSD为1.61%，表明供试品溶液室温放置24 h稳定。

2.8 有关物质的相关性 本方法进行了相关性考查试验，供试品溶液配制的称重在25～75 mg时，与有关物质测定之间有良好的相关性。

2.9 方法的粗放度 本方法用不同型号色谱柱测定同批样品(批号T3-11314417-3)有关物质，① Agilent XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、②Ultimate XB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、③Syncronis C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，在相同的色谱条件下，测定结果基本一致，本方法耐用性良好，可以作为控制土霉素质量的有效手段。见表1和表2。

1. 4-差向四环素 2. 土霉素 3. 2-乙酰-2-去酰胺土霉素 4. 四环素

2.10 有关物质的测定 取“2.2.1”和“2.2.2”项下的供试品溶液和对照溶液、 “2.3” 项下系统适用性试验溶液。取对照溶液10 μl注入液相色谱仪，其峰能检出(即信噪比大于10)。再精密量取供试品溶液和对照溶液各10 μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的4倍，供试品溶液色谱图中如有杂质峰， 2-乙酰-2-去酰胺土霉素杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的1.75倍(3.5%)，其他各杂质峰峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积(2.0%)。三批样品测定结果见表3。

表1 分离度测试溶液

表2 样品测定

表3 有关物质检查测定结果

3 讨论

3.1 因土霉素破坏性试验难以控制，参考国内外相关资料[3]，土霉素的有关物质采用主要杂质对照品定位来控制。现已定位的杂质有：4-差向土霉素、4-差向四环素、四环素和2-乙酰-2-去酰胺土霉素(土霉素自身含的杂质成分)。四环素和4-差向四环素的杂质对照品均由中国药品生物制品检定所提供。4-差向土霉素杂质对照品由厂家提供。而2-乙酰-2-去酰胺土霉素的杂质，就是土霉素中的最大单一杂质(参照《中国药典》2010版二部盐酸土霉素标准而定)，2-乙酰-2-去酰胺土霉素与土霉素主峰的相对保留时间约为1.1。未定位的杂质有：α和β-阿扑土霉素。因为目前尚无纯的α和β-阿扑土霉素杂质对照品提供；且以厂家提供的α和β-阿扑土霉素的杂质溶液，在分析条件下显现微量、峰形差且重现性不好而不能确定，既然α和β-阿扑土霉素杂质无法定位且微量，因此，如果检品中出现α和β-阿扑土霉素的杂质峰就按一般杂质检查，不另外再做其他研究。

3.2 由相关资料得出，各杂质校正因子为：2-乙酰-2-去酰胺土霉素斜率/盐酸土霉素=0.92；盐酸四环素斜率/盐酸土霉素=1.01；其校正系数均在0.8～1.1之间，因此，无需采用杂质校正因子。所以，土霉素也采用不加杂质校正因子，以自身对照作为有关物质检查的方法。

3.3 本方法是采用高效液相色谱法来测定有关物质，其结果可靠，经方法学验证，此方法专属性强、灵敏度高、准确度和重复性好，可作为土霉素的有关物质的检测方法。

1 国际药典[S].2011：1-3

2 中国药典[S]. 二部.2010:635-636

3 英国药典[S].2011：1635-1636，3078-3079

2014-09-19

R927.11

A

1006-5687(2015)02-0014-03