姜黄素治疗小鼠肝癌移植瘤的实验研究※

● 谢永进 魏 斌 陈跃达 丁伟基 徐 毅 李文鹏 卢传辉 尤 俊，3 罗 琪 黄正接，3▲



姜黄素治疗小鼠肝癌移植瘤的实验研究※

● 谢永进1，2魏 斌2陈跃达2丁伟基2徐 毅2李文鹏1卢传辉1尤 俊1，3罗 琪1，2黄正接1，2，3▲

目的：探讨姜黄素(Cur)对小鼠H22肝癌移植瘤的治疗作用及其可能的作用机制。方法： 构建肝癌小鼠模型，检测Cur对肝癌细胞的抑制作用，观察Cur对小鼠肝癌的治疗效果，测定Cur对肝癌组织血管内皮生长因子(VEGF)、微血管密度(MVD)的影响。结果： Cur能抑制治疗小鼠肝癌的生长、提高荷瘤小鼠的生存期、减少肝癌组织VEGF的表达、降低肝癌组织MVD。结论： Cur能抑制小鼠H22肝癌移植瘤的生长，机制可能是Cur减少VEGF的表达而抑制肿瘤微血管新生。

姜黄素 肝肿瘤 血管内皮生长因子 小鼠

肝细胞癌发病率高，但早期诊断率和生存率低，对人类的健康构成严重危害[1， 2]，因此，应用中草药治疗肝细胞癌成为我国广大肿瘤和中医工作者的研究热点。研究表明，姜黄素(curcumin，Cur)具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化和抑制血管生成等多方面的药理作用[3]。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)与其受体结合，能够促进新生血管的生成，为肿瘤的生长提供营养成分[4]。本实验以5-氟尿嘧啶阳性对照，观察姜黄素对小鼠肝癌H22细胞移植瘤的治疗效果，检测小鼠H22肝癌移植瘤中VEGF蛋白表达水平和微血管密度(microvessel density，MVD)，初步探讨姜黄素抑制肝癌血管生成的可能机制。

1 材料

1.1 主要试剂与仪器 姜黄素(生产批号：C1386，规格：5 g/支)、5-氟尿嘧啶 (生产批号：F6627，规格：1 g/支) 购自美国Sigma公司；二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑盐(MTT)购自美国Sigma公司；RPMI 1640培养基购自Gibco公司；牛血清白蛋白(BSA)、磷酸缓冲盐溶液(PBS) 购自杭州四季青生物工程材料有限公司； VEGF兔抗小鼠一抗、羊抗兔二抗试剂盒及显色液试剂盒均购自武汉博士德公司；免疫组织化学试剂盒购自福州迈新公司。Bio．RAD550全自动酶标仪购自美国伯乐公司。

1.2 细胞株与实验动物 小鼠肝癌H22细胞株由厦门大学附属第一医院肿瘤中心保存，雄性昆明种(KM)小白鼠80只，6～9周龄，体重(20±4)g，由厦门大学实验动物中心提供[动物许可证号SCXK(闽)2013-0001]，分笼饲养，室内温度控制在19～22℃，氨的质量分数为20×10-6，相对湿度为40%～50%，噪音<50dB。

2 方法

2.1 四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定姜黄素对H22肝癌细胞的抑制率 实验分为对照组(PBS)、姜黄素组(10.0 mol·L-1)、5-氟尿嘧啶组(100.0mol·L-1)和联合治疗组[姜黄素(10.0mol·L-1)联合5-FU(100.0mol·L-1]，每组设4个复孔，H22肝癌细胞贴壁生长后弃上清，每孔加入200μL新配制5mg/mL浓度的MTT，37℃孵育48h，用平板离心机离心(3000r·min-1，10min)，弃上清加入150μL的DMSO，震荡15min混匀，用Bio．RAD550全自动酶标仪测定吸光度(A)490nm值，每组设4个调零孔(不加细胞，只加200uL PBS)，细胞抑制率(%)=(1-实验组平均A490nm/对照组平均A490nm)×100%。

2.2 肝癌动物模型的建立 取对数生长期鼠源性肝癌H22细胞，用0.25%胰蛋白酶及0.02%EDTA消化收集细胞，磷酸缓冲液(PBS)洗涤重悬制成单细胞悬液(1×107个细胞·mL-1)，台盼蓝染色测定活细胞率≥90%，用1mL一次性注射器将细胞移植至小鼠右侧腋窝皮下，每点约2×106个细胞(即0.2mL)。每天测量肿瘤长径(L)和短径(w)，按公式V=0.5×L×W2计算肿瘤体积(V)[5]，待移植瘤长至约400mm3后进行药物治疗实验。

2.3 姜黄素对小鼠肝癌模型的治疗效果观察 H22肝癌移植瘤小鼠80只随机分为4组，每组20只。对照组、姜黄素组、5-氟尿嘧啶组分别通过腹腔注射PBS、5-氟尿嘧啶(100.0mol·L-1)、姜黄素(10.0mol·L-1)，每天1次，每只2mL；联合治疗组通过腹腔注射5-FU(100.0mol·L-1)、姜黄素(10.0mol·L-1)各1mL，每天1次。各组均连续腹腔注射给药5天。(1)各组分别取15只小鼠，于给药5天后处死，测定肿瘤的长和宽，计算肿瘤体积；完整剥离皮下肿瘤并称重，按以下公式计算抑瘤率：抑瘤率=(1-治疗组瘤重/对照组瘤重)×100%。称完后一半肿瘤组织置于液氮中备Western Blotting检测。另外一半肿瘤组织置于10%甲醛固定、组织脱水、石蜡包埋，以3um厚度连续切片，用于免疫组织化学检测。(2)每组剩余的5只小鼠，于给药后记录其生存时间。2.4 Western Blotting检测小鼠肝癌移植瘤组织中VEGF的表达 肿瘤组织块经冰PBS洗3次，剪碎，置入匀浆器，加入裂解液，冰浴匀浆10min，4℃离心，取上清，采用Braford法测定蛋白质浓度，按照总蛋白30ug的量在上样缓冲Buffer中煮沸10min，进行120g·L-1SDS-PAGE电泳分离蛋白，然后通过电转将目的蛋白及内参蛋白GAPDH转至PVDF膜上。PVDF膜在含5%脱脂奶粉的TBST溶液中封闭90min后，分别用VEGF兔抗小鼠抗体及内参一抗40C孵育过夜，然后用TBST洗涤10min×3次；加二抗辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体，室温孵育90min，再次洗涤10min×3次，增强化学发光显色液暗室显影，曝光处理后进行灰度值计算，以目的蛋白和内参蛋白灰度值比值作为目的蛋白相对表达量。

2.5 免疫组织化学检测小鼠肝癌移植瘤组织中VEGF的表达和MVD测定 采用链霉素亲和过氧化物酸(SP)法进行免疫组织化学染色，操作步骤按照免疫组织化学试剂盒说明进行。PBS替代一抗作为每次染色阴性对照，以已知阳性切片作为阳性对照，VEGF表达阳性为胞浆内出现棕黄色颗粒。免疫组化染色评分按Rahman等[6]报道的方法进行，即VEGF的评分标准，根据染色范围(阳性细胞比率)和染色强度评价。染色范围(阳性细胞比率)分为0～4分：阴性为0分，阳性细胞1%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分；染色强度划分为0～3分：阴性为0分，弱阳性为1分，中等强度为2分，强阳性为3分，两者得分相加为最后评分。MVD测定按Bosari等[7]报道的方法进行，先在40倍视野下选取肿瘤微血管最丰富的区域，然后在200倍视野范围计数被染成棕黄色的微血管数目，取3个数值的平均值作为MVD值。

3 结果

3.1 姜黄素对小鼠H22肝癌细胞的的抑制作用 MTT法检测各组细胞的生长抑制率，结果显示，姜黄素组、5-氟尿嘧啶组和联合治疗组对小鼠H22肝癌细胞的抑制率均高于对照组(P<0.05)；与姜黄素组、5-氟尿嘧啶组比较，联合治疗组对小鼠H22肝癌细胞的生长抑制率较高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 MTT法检测姜黄素对H22细胞的增殖抑制率(±s，n=4，%)

注：与对照组比较，aP<0.05;与姜黄素联合5-氟尿嘧啶组比较，bP<0.05。

3.2 姜黄素对小鼠H22肝癌移植瘤的治疗效果 小鼠移植瘤长至约400mm3后开始治疗，4组小鼠给药后5d内均无死亡。(1)姜黄素组和5-氟尿嘧啶组的最终肿瘤体积、最终瘤重均比对照组小，但都明显大于联合治疗组的肿瘤体积、最终瘤重，差异有显著统计学意义(P<0.05)，联合治疗组的抑瘤率为76.75%，高于姜黄素组、5-氟尿嘧啶组的抑瘤率(P<0.05)。(2)与对照组、姜黄素组、5-氟尿嘧啶组比较，联合治疗组的小鼠生存期最长(P<0.05)，姜黄素组、5-氟尿嘧啶组小鼠的生存时间长于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 姜黄素对小鼠H22肝癌移植瘤的治疗效果(±s)

注：与对照组比较，aP<0.05;与联合治疗组比较，bP<0.05。

3.3 姜黄素对小鼠肝癌移植瘤组织中VEGF表达的影响 Western Blotting结果显示，姜黄素组和5-氟尿嘧啶组小鼠肝癌移植瘤组织中的VEGF蛋白相对表达量分别为(4.06±1.08)、(2.86±0.98)，与对照组(5.78±0.66)比较均明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)；而联合治疗组小鼠肝癌移植瘤组织中的VEGF蛋白相对表达量(0.98±0.08)明显低于姜黄素组、5-氟尿嘧啶组(P<0.05)。见图1。

1：对照组；2：姜黄素组；3：5-氟尿嘧啶组；4：联合治疗组

图1 Western Blotting检测VEGF蛋白表达

3.4 姜黄素对小鼠肝癌移植瘤组织中VEGF的表达和微血管密度的影响 免疫组织化学检测结果显示，姜黄素组、5-氟尿嘧啶组和联合治疗组小鼠肝癌移植瘤组织的VEGF表达评分明显低于对照组，MVD少于对照组(P<0.05)；进一步比较发现，联合治疗组小鼠肝癌移植瘤组织的VEGF表达评分、MVD均少于姜黄素组、5-氟尿嘧啶组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2、表3。

A：对照组；B：姜黄素组；C：5-氟尿嘧啶组；D：联合治疗组

图2 免疫组织化学检测小鼠H22肝癌移植瘤组织中VEGF的表达和MVD(SP×400)

表3 H22肝癌移植瘤VEGF表达评分和MVD(±s，n=15 )

注： 与对照组比较，aP< 0.05; 与联合治疗组比较，bP<0.05。

4 讨论

肝细胞癌恶性度高，在我国具有高发病率、低手术切除率的特点，肝动脉化疗栓塞为主的综合治疗是目前治疗不能根治切除的肝细胞癌的首选方法，但是肝动脉化疗栓塞选择性不强，可能会栓塞到正常组织器官的供血动脉引起相应并发症，而且肝癌对化疗药物的敏感性差[8]。因此，中晚期HCC患者目前治疗效果不佳，死亡率高。

有研究表明，VEGF在肝癌组织和癌旁组织的表达高于正常肝组织[9]，机制在于肝癌生长迅速，肝癌组织血液供应难以满足肿瘤细胞快速生长的需要，肿瘤内部处于相对缺血、缺氧的微环境， 从而上调VEGF的表达，肿瘤细胞VEGF的合成增加[10]。VEGF能诱导新生毛细血管的形成，促进肿瘤持续生长以及肿瘤基质的形成，是目前所知最强的血管活性因子之一；同时，VEGF 所诱导的新生血管基底膜不完整， 缺乏血管壁的屏障作用， 肿瘤细胞容易通过VEGF 所诱导的新生血管基底膜进入血液循环而发生血行转移[4， 11]。在肝癌的发生、发展和转移过程中，VEGF发挥着重要的作用，靶向VEGF抑制肿瘤新生血管的形成从而达到治疗肝癌的目是目前的研究热点。

姜黄素是中药姜黄的提取物，具有多方面的药理作用，如抑制肿瘤新生血管的形成、抗炎、抗氧化、降血脂[12， 13]。本研究MTT法检测姜黄素对H22肝癌细胞的生长抑制率， 结果显示，姜黄素组、5-氟尿嘧啶组对小鼠H22肝癌细胞的抑制率均高于对照组；联合治疗组对小鼠H22肝癌细胞的生长抑制作用最强。H22肝癌细胞荷瘤小鼠经腹腔注射药物治疗后，姜黄素组、5-氟尿嘧啶组的最终肿瘤体积、最终瘤重均比对照组小，但都明显大于联合治疗组的肿瘤体积、最终瘤重。姜黄素组小鼠的生存时间长于对照组，与其它3组比较，联合治疗组的小鼠生存期最长、抑瘤率最大。进一步Western Blotting检测小鼠肝癌移植瘤组织中的VEGF蛋白表达量，发现姜黄素组和联合治疗组的VEGF蛋白相对表达量均低于对照组。有研究表明[14]，肿瘤血管生成与肿瘤的生长、进展和转移关系密切，血管生成是一个微血管新生的过程，微血管密度(MVD)是反映肿瘤血管生成的指标之一， 可能预测肿瘤转移、复发和预后。本实验采用免疫组织化学技术测定MVD，进行VEGF表达评分，发现姜黄素组和联合治疗组的小鼠肝癌移植瘤组织中的MVD和VEGF评分都明显低于对照组。上述结果证实，姜黄素下调肝癌细胞中VEGF蛋白表达，抑制了肝癌血管的形成，引起肿瘤细胞缺血、坏死，从而抑制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠的生存时间。在联合治疗组中，姜黄素和5-氟尿嘧啶的给药剂量都是单药治疗组的一半，但是联合治疗组的抑瘤效果比姜黄素组、5-氟尿嘧啶组好，生存期也明显延长，姜黄素联合5-氟尿嘧啶给药能够提高疗效，减少5-氟尿嘧啶的用药剂量，减少化疗药物的毒副作用。

本研究通过治疗实验证实姜黄素能抑制肝癌H22小鼠移植瘤的生长，机制可能是姜黄素减少肝癌组织VEGF的表达而抑制肿瘤微血管新生。同时，姜黄素联合5-氟尿嘧啶对肝癌H22小鼠移植瘤的抑瘤作用明显好于对照组、姜黄素组和5-氟尿嘧啶组， 提示姜黄素不仅能抑制H22肝癌细胞的增殖，而且与化疗药物5-氟尿嘧啶有协同效果。本研究的初步结果为姜黄素在肝癌的抗血管生成治疗提供了一定的应用依据，但是具体机制需要进一步探索研究。

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福建省医学创新课题(No.2012-CXB-29)；福建省科技计划重点项目(No.2014D017)；福建省厦门市科技计划项目(No.3502Z20134011；No.3502Z20124018)

1.厦门大学附属第一医院厦门市肿瘤中心(361003)；2.福建医科大学第一临床医学院(350004)；3.福建中医药大学第一临床医学院(350122)

▲通讯作者 黄正接，男，副主任医师，副教授，硕士研究生导师。主要从事肿瘤外科疾病的临床研究。主持科研项目2项，发表论文16篇，其中SCI收录3篇，Medline收录5篇。E-mail： h74zj@126.com