丙酮酸乙酯对脑出血大鼠血清肿瘤坏死因子α和白介素6水平的影响

邓 楠，杨光伟，李小刚

·论著·

丙酮酸乙酯对脑出血大鼠血清肿瘤坏死因子α和白介素6水平的影响

邓 楠，杨光伟，李小刚

目的 探讨丙酮酸乙酯对脑出血大鼠血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)水平的影响。方法 采用自体动脉血制备脑出血模型，将48只清洁级SD大鼠随机分为假手术组(F组，n=8)、脑出血组(ICH组，n=20)和丙酮酸乙酯干预组(EP组，n=20)。F组大鼠只进针，不注血；ICH组大鼠建立脑出血模型后腹腔注射0.9%氯化钠溶液；EP组大鼠建立脑出血模型后腹腔注射丙酮酸乙酯，每组大鼠按建模时间(6 h、24 h、3 d、7 d)不同分为4个亚组。评估各组大鼠不同建模时间点神经功能缺损程度，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测大鼠不同建模时间点血清TNF-α、IL-6水平。结果 ICH组不同建模时间点神经功能缺损评分低于EP组，EP组低于F组(P<0.05)。ICH组大鼠不同建模时间点血清TNF-α水平高于F组和EP组，ICH组和EP组大鼠不同建模时间点血清IL-6水平高于F组，除建模24 h 外ICH组大鼠血清IL-6水平均高于EP组(P<0.05)。结论 脑出血后大鼠神经功能受损，血清TNF-α、IL-6等炎性因子水平升高。丙酮酸乙酯能降低血清TNF-α、IL-6等炎性因子水平，抑制炎性反应，对脑出血大鼠具有脑保护作用。

脑出血；丙酮酸乙酯；肿瘤坏死因子α；白介素6；大鼠

脑出血是一种常见的脑血管疾病，其发病率和致残、致死率均高。大量研究表明，脑出血后炎性细胞趋化于血肿周围并释放炎性因子[1]，从而诱导肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)等炎性因子的表达，参与脑水肿、炎性反应等引起继发性脑损害[2]。丙酮酸乙酯可以通过减少TNF-α和IL-6的表达而减轻炎性反应和缺血再灌注引起的器官损伤[3]，从而实现脑保护作用。目前，关于丙酮酸乙酯对脑出血后血清炎性因子影响的相关研究尚少，本实验通过检测大鼠脑出血后不同时间点血清炎性因子TNF-α、IL-6的表达情况，探讨丙酮酸乙酯对脑出血大鼠血清炎性因子TNF-α和IL-6水平的影响，以阐述丙酮酸乙酯对脑出血大鼠的脑损伤保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级SD大鼠48只，成年雄性，体质量300～350 g，由泸州医学院实验动物中心提供。

1.2 主要试剂与仪器 丙酮酸乙酯(98%)(美国Sigma公司)用Ringer′s液配制浓度为1 mg/ml，TNF-α酶联免疫试剂盒(上海西塘)，IL-6酶联免疫试剂盒(上海西塘)，低温离心机(上海安亭科学仪器厂)，MK3酶标仪(德国Thermo公司)，MK2洗板机(德国Thermo公司)，数字显示隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)，漩涡混合器(上海青浦沪西仪器厂)，眼科手术器械一套，脑立体定位仪，分光光度仪。

1.3 实验分组 采用随机数字表法将SD大鼠分为3组。(1)假手术组(F组)(n=8)：只进针，不注血。(2)脑出血组(ICH组)(n=20)：建立脑出血模型后2 h腹腔注射0.9%氯化钠溶液(40 mg/kg)，之后1次/d，至动物被处死。(3)丙酮酸乙酯干预组(EP组)(n=20)：建立脑出血模型后2 h腹腔注射丙酮酸乙酯(40 mg/kg)，之后1次/d，至动物被处死。每组按建模时间(6 h、24 h、3 d、7 d)不同分为4个亚组。

1.4 脑出血模型制备 参照文献[4]方法建立脑出血模型，将1%戊巴比妥钠按0.4 ml/100 g剂量进行腹腔注射，取大鼠自体动脉血后将其固定于立体定向仪上，微量进针器沿进针点垂直进针6 mm，达到大脑尾状核后将血液缓慢注入大鼠颅内，假手术组方法同前，但只进针，不注血。

1.5 神经功能缺损评分 处理后大鼠在各亚组相应时间点采用Garcia等[5]制定的评分法进行神经功能缺损评分，最高分18分，最低分3分，分数越低神经功能缺损程度越严重。

1.6 标本的采集与检测 取大鼠腔静脉血4 ml，离心(3 000 r/min)10 min后吸取上清液保存于-20 ℃冰箱。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测大鼠血清TNF-α、IL-6水平，具体操作步骤严格按说明书进行。

2 结果

2.1 3组大鼠不同建模时间点神经功能缺损评分比较 3组大鼠建模6 h、24 h、3 d、7 d神经功能缺损评分比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中ICH组不同建模时间点神经功能缺损评分低于EP组，EP组低于F组，差异有统计学意义(P<0.05)。ICH组大鼠建模3 d神经功能缺损评分低于其他建模时间点，差异有统计学意义(P<0.05，见表1、图1)。

Table 1 Comparison of neural function defect score among 3 groups of rat at different modeling time points

组别只数6h24h3d7dF组214 5±0 715 5±0 716 0±0 015 5±0 7ICH组57 4±0 9∗7 2±0 8∗6 0±1 0∗★7 6±0 9∗EP组59 8±0 8∗▲10 4±0 5∗▲11 4±0 7∗▲9 8±0 8∗▲F值51 81111 57121 9063 79P值0 000 000 000 00

注：与F组比较，*P<0.05；与ICH组比较，▲P<0.05；与同组其他时间点比较，★P<0.05。F组=假手术组，ICH组=脑出血组，EP组=丙酮酸乙酯干预组

注：F组=假手术组，ICH组=脑出血组，EP组=丙酮酸乙酯干预组

图1 3组大鼠不同建模时间点神经功能缺损评分比较

Figure 1 Comparison of neural function defect score among 3 groups of rat at different modeling time points

2.2 3组大鼠不同建模时间点血清TNF-α水平比较 3组大鼠建模6 h、24 h、3 d、7 d血清TNF-α水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中ICH组大鼠不同建模时间点血清TNF-α水平高于F组和EP组，差异有统计学意义(P<0.05)。ICH组大鼠建模3 d血清TNF-α水平高于其他建模时间点，差异有统计学意义(P<0.05，见表2、图2)。

2.3 3组大鼠不同建模时间点血清IL-6水平比较 3组大鼠建模6 h、24 h、3 d、7 d血清IL-6水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中ICH组和EP组大鼠不同建模时间点血清IL-6水平高于F组，除建模24 h 外ICH组大鼠血清IL-6水平均高于EP组，差异有统计学意义(P<0.05)。ICH组大鼠建模3 d血清IL-6水平高于其他建模时间点，差异有统计学意义(P<0.05，见表3、图3)。

Table 2 Comparison of serum TNF-α level among 3 groups of rat at different modeling time points

组别只数6h24h3d7dF组257 07±6 6731 65±2 6438 70±2 8545 95±3 40ICH组5136 09±14 19∗201 29±23 03∗253 08±16 61∗★219 81±45 17∗EP组569 28±7 04▲135 97±17 27∗▲50 18±5 53▲56 20±11 15▲F值62 8056 82452 8342 06P值0 000 000 000 00

注：与F组比较，*P<0.05；与ICH组比较，▲P<0.05；与同组其他时间点比较，★P<0.05

图2 3组大鼠不同建模时间点血清TNF-α水平比较

Figure 2 Coparison of serum TNF-α level among 3 groups of rat at different modeling time points

Table 3 Comparison of serum IL-6 level among 3 groups of rat at different modeling time points

组别只数6h24h3d7dF组227 26±1 2419 03±2 6133 80±2 6018 89±1 46ICH组580 83±6 12∗162 15±17 34∗191 21±21 66∗★171 11±20 79∗EP组564 38±7 55∗▲126 68±18 81∗78 85±7 16∗▲44 17±5 84∗▲F值48 6150 31104 81128 71P值0 000 000 000 00

注：与F组比较，*P<0.05；与ICH组比较，▲P<0.05；与同组其他时间点比较，★P<0.05

图3 3组大鼠不同建模时间点血清IL-6水平比较

Figure 3 Comparison of serum IL-6 level among 3 groups of rat at different modeling time points

3 讨论

脑出血是一种常见的脑血管疾病，其发病率和致残、致死率均较高。脑损伤包括血肿占位效应及脑水肿、血-脑脊液屏障破坏、细胞凋亡[6]、细胞兴奋性损害等，其中炎性因子贯穿于脑损伤与修复的整个过程，被认为与神经元损伤、预后有密切关系。研究发现，脑出血后小胶质、巨噬细胞、白细胞等炎性细胞迅速浸润到出血组织中参与血肿清除，而另一方面过度活化的炎性细胞大量释放氧自由基、一氧化氮(NO)、炎性因子等参与免疫炎性反应，增加血-脑脊液屏障通透性，导致脑损伤和神经元凋亡[7]。张健等[8]研究认为，血清TNF-α、IL-6水平与脑出血严重程度呈正相关，其水平持续升高提示患者预后差。IL-6由胶质细胞、淋巴细胞、血管内皮细胞等多种细胞产生，在中枢神经系统中发挥神经保护及神经毒性双重作用，低水平IL-6具有促进神经分化与修复的作用，而高水平IL-6则具有损伤神经的作用[9]。周洪霞等[10]在大鼠脑出血的血肿周围脑组织内检测到高水平IL-6，其水平与脑水肿变化趋势一致，因此认为IL-6参与脑水肿的形成。TNF-α是一种多功能的促炎性细胞因子，具有多种生物活性，能广泛参与炎性反应及免疫调节，脑出血后其可迅速被炎性细胞激活[11]，通过改变血-脑脊液屏障和诱导趋化因子的表达而加重脑组织炎症，还能诱导星形胶质细胞分泌谷氨酸参与细胞毒性作用[12]。Manye等[13]研究发现，TNF-α能促进脑出血血肿周围炎性反应，引起脑出血后继发性脑损伤。

既往丙酮酸乙酯常用于治疗心肌梗死、急性胰腺炎、休克、烧伤、急性颅脑损伤、缺血再灌注损伤等，具有抗感染、清除自由基、保护心肌、降低胆固醇等作用[14]。曾涟等[15]在脓毒血症大鼠模型研究中发现，丙酮酸乙酯能减少血清中炎性因子如TNF-α、IL-6等水平、减轻器官功能损害。丙酮酸乙酯中的丙酮酸(CH3COCOOH)能穿透血-脑脊液屏障进入脑内发挥脑保护作用[16]。研究发现，丙酮酸乙酯能抑制由中性粒细胞激活释放的炎性因子(如TNF-α、IL-6等)及黏附因子的表达，通过抑制TNF的释放及活性而达到减轻脑内炎性损伤、保护脑组织的作用[17]。

本研究结果表明，大鼠脑出血后神经功能缺损评分下降，血清TNF-α、IL-6水平升高，提示脑出血后存在炎性反应。ICH组大鼠建模6 h血清TNF-α、IL-6水平开始上升，于建模3 d达到高峰，且其水平高于F组和EP组。这与国内外相关实验报道相符合，进一步证实了脑出血后炎性反应对脑组织的损伤。经丙酮酸乙酯治疗的脑出血大鼠不同建模时间点神经功能缺损评分高于ICH组，血清TNF-α、IL-6水平低于ICH组，表明丙酮酸乙酯有助于恢复脑出血大鼠的神经功能，其作用机制可能与减少炎性因子、减轻氧化应激反应有关。

综上所述，丙酮酸乙酯能保护脑出血大鼠神经元、改善神经功能、抑制炎性反应，为临床治疗脑出血提供新的思路，但药物治疗剂量、治疗时间窗及药物不良反应仍有待进一步研究。

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(本文编辑：谢武英)

Influence of Ethyl Pyruvate on Serum Levels of TNF-α and IL-6 in Rats with Cerebral Hemorrhage

DENGNan，YANGGuang-wei，LIXiao-gang.DepartmentofNeurology，People′sHospitalofLuzhou，Luzhou646000，China

Objective To investigate the influence of ethyl pyruvate on serum levels of TNF-α and IL-6 in rats with cerebral hemorrhage.Methods A total of 48 specific pathogen free Sprague-Dawley rats were selected and randomly divided into groups A(n=8)，B(n=20)，C(n=20).A group was given sham-operation，B group was given autologous arterial blood to build cerebral hemorrhage model and then given intraperitoneal injection of 0.9% sodium chloride solution，C group was given autologous arterial blood to build cerebral hemorrhage model and then was given intraperitoneal injection of ethyl pyruvate.After 6 hours，24 hours，3 days，7 days of intervention，2，5，5 rats were randomly picked out from groups A，B，C，respectively，and the degree of nervous functional defects was evaluated，ELISA to used to detect the serum levels of TNF-α and IL-6.Results The nervous functional defects score of B group was lower than that of C group at each time point，respectively，and that of C group was lower than that of A group，respectively(P<0.05).The serum TNF-α level of B group was higher than that of groups A and C at each time point，respectively；the serum IL-6 level of groups B and C was higher than that of A group at each point，respectively，and serum IL-6 level of B group was higher than that of C group after 6 hours，3 days，7 days of intervention.Conclusion Rats with cerebral hemorrhage have different degrees of nervous functional defects，and the serum levels of TNF-α and IL-6 are higher；ethyl pyruvate can reduce the serum levels of TNF-α and IL-6，inhibit the inflammatory reactions，has some cerebral protection effect.

Cerebral hemorrhage；Ethyl pyruvate;Tumor necrosis factor-alpha；Interleukin-6；Rats

646000四川省泸州市人民医院神经内科(邓楠)；泸州医学院附属医院神经外科(杨光伟)，神经内科(李小刚)

邓楠，杨光伟，李小刚.丙酮酸乙酯对脑出血大鼠血清肿瘤坏死因子α和白介素6水平的影响[J].实用心脑肺血管病杂志，2015，23(2)：49-52.[www.syxnf.net]

R 743.34

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2015.02.015

2014-08-16；

2015-01-23)

Deng N，Yang GW，Li XG.Influence of ethyl pyruvate on serum levels of TNF-α and IL-6 in rats with cerebral hemorrhage[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2015，23(2)：49-52.