埃博拉病毒病疫苗研究进展

金宏丽，王化磊，郑学星，杨松涛，夏咸柱

埃博拉病毒（Ebola virus,EBOV）是丝状病毒科成员，为有囊膜、单股负链RNA病毒，可编码7种蛋白：核蛋白（NP）、病毒结构蛋白（VP35、VP40）、糖蛋白（GP）、额外病毒结构蛋白（VP30、VP24）和RNA依赖的RNA聚合酶（L）[1-2]。EBOV感染人后，可引起严重的急性埃博拉病毒病（Ebola virus disease,EVD）。自1976年扎伊尔首次暴发EVD以来，现已知5种病毒亚型在人类和非人灵长类中暴发，包括扎伊尔型（Zaire EBOV,EBOV-Z）、苏丹型（Sudan EBOV,EBOV-S）、塔伊森林型、莱斯顿型和本迪布焦型[3]。2014年3月21日几内亚首次报道近期EVD的暴发，随即迅速在几内亚、利比里亚、塞拉利昂、马里、尼日利亚和塞内加尔传播，同时美国和西班牙的医护人员也感染此病[4]。据WHO 2015年1月27日发布的最新报告显示，此次疫情中，全球共22 057人感染EBOV，死亡8795例，超过以往EVD病死人数的总和。目前尚无有效的EVD治疗药物和疫苗，WHO已将EBOV列为对人类危害最严重的病毒之一。严峻的疫情推进了全球对EDV疫苗的研究。

1 评价疫苗的动物模型

1.1 小鼠 丝状病毒对健康的成年小鼠无致死性，因此只能通过适应小鼠的病毒株或免疫缺陷小鼠进行动物模型的构建。通过在乳鼠体内进行病毒连续传代，获得适应小鼠的EBOV株，可使成年鼠致死，但仅腹膜内注射可致死，肌内注射和皮下注射均不致死。或者通过构建重度免疫缺陷病、敲除信号转导和转录物1激活物（signal transducer and activator of transcription 1 knock-out,STAT1-/-）或敲除干扰素α/β受体的小鼠模型，感染野生型EBOV后可引起死亡[5]。通过如上方法构建的小鼠模型感染EBOV后，初始靶细胞和组织的感染变化与人和非人灵长类的感染变化一致[5]。但在疾病发生过程中，不出现凝血功能异常，而人和非人灵长类感染EBOV后，凝血功能异常是一个重要的特征。并且，小鼠具有天然的抗EBOV能力，因此根据其实验结果不能完全预测疫苗对非人灵长类的效果。但如果疫苗对小鼠模型不能提供完全保护，那么此疫苗在其他动物模型中很可能也不会成功。因此，尽管小鼠模型有局限性，但仍可应用于疫苗的评价。

1.2 豚鼠 豚鼠感染野生型EBOV后，不会或很少表现临床症状，因此只能使用豚鼠适应株建立豚鼠模型。豚鼠感染EBOV后，被感染的靶细胞和组织变化情况与人和非人灵长类一致，并且出现凝血功能异常，但纤维蛋白原无变化。然而，不能说明豚鼠模型比小鼠模型更能证明疫苗的有效性，也不能说明豚鼠模型更能预测疫苗对非人灵长类的效果。

1.3 金黄地鼠 将小鼠适应株感染成年的金黄地鼠可致死，以此建立的金黄地鼠模型[6]感染EBOV后，可出现严重的凝血功能异常，包括纤维蛋白原和蛋白C水平的异常。此模型还出现细胞因子水平异常和Ⅰ型干扰素反应的抑制情况，可能与丝状病毒感染后导致的病理生理学有关。然而，与豚鼠模型一样，疫苗在金黄地鼠模型上的评价也受限制。

1.4 非人灵长类 EBOV对非人灵长类有高致死性[7]。证据表明，过去非洲人群暴发EVD可能由于大量非人灵长类死亡、通过狩猎和食用野味与被感染的非人灵长类接触所致[8]。因此，多种非人灵长类被作为模型研究EBOV感染机制。多数研究使用短尾猴或恒河猴，也有研究使用非洲绿猴、狒狒和狨猴。非人灵长类模型感染病毒时的典型病理学和临床特征均与人的症状相同，因此是用于疫苗和药物评价研究的“金标准”动物模型[7，9]。疫苗在给人类使用前均必须使用非人灵长类模型对其进行安全性和效力评价，但因攻毒须在4级生物安全实验室中进行，操作困难，成本高，并须考虑道德问题。因此，在使用非人灵长类进行疫苗评价之前，必须先在一个或多个小动物模型中证明疫苗的有效性。

近年来，狨猴[10]作为非人灵长类模型较受欢迎。狨猴对天然的丝状病毒高度易感[10]，且感染EBOV后出现病理学特征，病情发展不迅速，而猕猴和50%患者病情发展迅速。成年狨猴体重为300～400g，相比其他非人灵长类，体型小，便于操作，需要的生活空间也相对小，且不携带猴源疱疹B型病毒（常在猕猴体内潜伏，对人类致病）[11]。后代常为双胞胎[12]，方便使用于对照、被动转移免疫细胞或抗体的试验。

2 疫苗的种类

目前缺乏有效治疗手段，因此，研制有效预防和控制EVD暴发的疫苗极为迫切。在过去20年里，有多种疫苗被研发，且在不同动物模型中研究其有效性，每种疫苗均有其独特的优点和限制性[13]。

2.1 灭活疫苗 在早期研究中，将EBOV通过福尔马林灭活或热灭活后，可对豚鼠提供保护，但对照组13只中仅有4只有致死性感染，说明使用的攻击毒株不适用于豚鼠。随后的实验表明，灭活的EBOV不能对非人灵长类提供保护[14]。此外，通过碘萘基叠氮化物灭活病毒，可保护机体免遭致死性病毒的攻击，但如果使用γ射线灭活，就不会达到同样的保护效果，说明灭活方法可能会影响病毒蛋白的结构和免疫原性[15]。虽然灭活疫苗可避免预存免疫和载体本身诱导的免疫反应问题，但须在4级生物安全实验室中操作活病毒，成本高，且面临安全性等问题，限制了此类疫苗的发展。

2.2 复制子疫苗 委内瑞拉马脑炎病毒（Venezuelan equine encephalitis virus,VEEV）复制子表达EBOV GP或NP蛋白后，被用于EDV疫苗的研究。单独免疫表达NP的VEEV复制子可对小鼠提供完全保护，单独免疫表达GP的VEEV复制子可对豚鼠提供完全保护，将二者联合免疫，既可保护小鼠，又可保护豚鼠。但不论是单独免疫还是联合免疫，即使免疫剂量为107病灶形成单位（focus－forming units,FFU）也不能保护短尾猴。当免疫剂量达到1010FFU时，才可保护非人灵长类[16]。需高剂量免疫和预存免疫限制了此疫苗在人类中的应用。

库京病毒，为黄病毒家族的一员，具有自我复制RNA能力，以此病毒为基础制备的复制子疫苗可保护25%～86%的豚鼠[17]。此疫苗未在非人灵长类中进行评价，且虽然VEEV复制子疫苗对豚鼠提供100%保护，但需要高剂量才能保护非人灵长类，因此库京病毒复制子疫苗的前景不被看好。

2.3 DNA疫苗 已研究的DNA疫苗被证明可保护小鼠和豚鼠免遭致死性EBOV的攻击[18－19]，且可多次反复注射以增强免疫反应。已有DNA疫苗用于Ⅰ期临床试验，证明其安全并有免疫原性[19]。然而，尚未在非人灵长类模型中评价DNA疫苗的效果。

2.4 亚单位疫苗 利用杆状病毒表达系统，在昆虫细胞内生产EBOVGP蛋白并纯化后，免疫豚鼠1次，或在免疫DNA疫苗后作为加强免疫，可诱导产生较高水平的抗体，但不能保护机体免遭病毒的攻击，且保护率与中和抗体水平间无对应关系。Konduru等[20]将人IgG1的Fc片段连入EBOV GP蛋白胞外域的C末端构建融合蛋白，纯化后辅入佐剂进行免疫，结果90%的小鼠被保护。结果证明，纯化的GP可激发机体产生保护性免疫反应，但尚须进一步进行优化，并应用其他动物模型进行效果评价。

病毒样颗粒（virus－like particles,VLPs）以其独特特点吸引研究者关注：可对免疫个体进行多次免疫；由于VLPs空间结构与天然病毒相似，因此诱导中和抗体的能力比可溶性抗原更强；VLPs易被抗原提呈细胞（如树突状细胞）捕获，从而刺激机体产生抗体和细胞免疫反应；可将免疫刺激分子融合表达于VLPs中，用以增强免疫反应[21－22]。最早的研究是将表达GP和VP40蛋白的DNA载体转染人293T细胞后获得EBOV VLPs，3次免疫后，可保护小鼠。如果在VLPs中加入佐剂，2次免疫小鼠即可抵抗高剂量病毒的攻击，免疫1次就可保护豚鼠[23]，还可保护非人灵长类[24]，首次证明非病毒载体疫苗在非人灵长类模型中可激发保护性免疫反应。此外，也可利用昆虫细胞生产VLPs，其形态和功能均与在哺乳动物中生产的相似，可在小鼠体内激发有效的保护反应[25]。使用昆虫细胞生产提高了产量，大幅度降低了生产成本，且昆虫细胞更安全，但须在非人灵长类模型中验证其有效性。

2.5 复制缺陷型EBOV 利用反向遗传技术，可对EBOV基因组进行改造[26]。通过将转录激活物VP30的基因去除，获得没有复制能力的EBOV（rEBOVΔVP30）。将rEBOVΔVP30接种可稳定表达VP30的细胞系后，病毒可感染细胞产生子代病毒，但由于基因组缺少VP30，因此子代病毒无感染能力，即生命周期为单周期。用此方法繁殖得到的复制缺陷型病毒，对STAT1-/-小鼠不致病，且可对小鼠和豚鼠提供100%的保护[27]。但由于rEBOVΔVP30基因组仍含有95%的EBOV基因组，因此对其安全性有疑虑，尤其担心在病毒传代过程中，是否会重组VP30用以完善自身的基因组。然而实验表明，连续传代至少7代以内，没有发现重组现象，并且以目前对丝状病毒的了解，此重组现象理论上不会发生。

2.6 病毒载体疫苗

2.6.1 重组5型腺病毒（adenovirus type 5,Ad5）疫苗 重组Ad5疫苗是最早被研究的重组活载体疫苗，也可能是EDV疫苗平台中最为领先的疫苗[28]，被证明在非人灵长类中可提供有效保护。早期研究中，对非人灵长类首次免疫可表达EBOV GP的DNA疫苗，再加强免疫可表达GP的人Ad5疫苗，可保护机体免遭致死性EBOV的攻击，首次证明了通过免疫可保护非人灵长类[6]。随后实验表明，将表达GP和NP蛋白的重组Ad5混合，对非人灵长类免疫1次即可提供保护[28]。后续实验进一步证明，单独免疫表达GP的重组Ad5，最低免疫剂量为1010噬斑形成单位即可对非人灵长类提供足够的保护[29]。然而，由于腺病毒的预存或抗载体免疫，限制了此疫苗的发展。如果研制非注射用疫苗（如口服或滴鼻免疫）或非人类病毒载体疫苗，可能会给Ad5载体疫苗带来希望。对此，一种新型鼻部喷雾疫苗[30]已被研制，该疫苗使用弱化的重组Ad5表达EBOV GP蛋白，对非人灵长类免疫后62 d能提供部分保护（67%），免疫后150 d体内仍存在针对GP蛋白的T细胞群和抗体。下一步将进行Ⅰ期临床试验来检测这种疫苗在人类中的效果。Stanley等[31]使用黑猩猩来源的复制缺陷型腺病毒（chimpanzeederived replication-defective adenoviral,ChAd）为载体，将表达GP蛋白的ChAd3载体疫苗免疫非人灵长类1次，5周后进行存活率实验。结果表明，疫苗可刺激机体产生抗GP的抗体和特异性T细胞反应，并可对机体提供100%的保护。

2.6.2 重组水泡型口炎病毒（vesicularstomatitis virus,VSV）疫苗 通过反向遗传操作，将EBOVGP蛋白替换VSV的G蛋白获得的重组VSV[32]，免疫1次，即可保护小鼠、豚鼠和非人灵长类免遭病毒的攻击[33]。在非人灵长类感染病毒后，此疫苗也可保护机体，说明其有暴露后预防治疗的可能性[34]。

2.6.3 重组狂犬病病毒（rabies virus,RABV）疫苗 将表达GP的重组RABV免疫1次可保护部分小鼠[35]，免疫2次可保护100%的非人灵长类[36]。尽管重组RABV疫苗效果比重组VSV低，但将表达GP的重组RABV灭活后，可部分保护非人灵长类，提示可考虑将此类疫苗以灭活形式应用，这样对人类更为安全。

2.6.4 重组副粘病毒疫苗 除了以弹状病毒（例如VSV和RABV）为载体外，以重组副粘病毒为载体也被用于EDV疫苗研发。单独表达EBOVGP蛋白或同时表达GP和NP蛋白的重组人副流感病毒3型（human parainfluenza virus 3,HPIV3）免疫 1次，可对豚鼠提供保护。但在非人灵长类中，须免疫2次才可提供完全保护。在人群中有针对HPIV3的免疫，为了避免预存免疫干扰疫苗免疫原性，通过去除HPIV3表面糖蛋白F和HN蛋白（预存免疫抗体针对的靶标位点）的基因，制备新型重组病毒，虽复制能力下降，但免疫1次即可保护豚鼠[37]。以新城疫病毒（newcastle disease virus,NDV）为载体也用于疫苗研发，首次免疫时使用重组NDV，加强免疫时使用重组HPIV3，在非人灵长类中可引起良好免疫反应[38]。然而，此种疫苗在非人灵长类中的保护性未有报道。将一种新病毒引入人类中应用是此类疫苗主要担心的问题。

2.6.5 重组巨细胞病毒（cytomegalovirus,CMV）疫苗 表达EBOV NP蛋白T细胞表位的重组CMV疫苗免疫小鼠后可保护小鼠免受病毒攻击[39]。但灵长类动物体内存在CMV，且CMV有高度的宿主特异性。因此，进一步研究时，须考虑其有效性和安全性问题。

2.6.6 重组牛痘病毒（vaccinia virus,VV）疫苗 表达EBOV蛋白的重组VV也可诱导机体产生保护性免疫反应。表达EBOV GP蛋白的重组VV疫苗可对豚鼠提供保护，但不能保护非人灵长类[14]，说明此疫苗还有缺陷。

3 进入临床试验的疫苗

通常情况下经过多年的努力，疫苗才可进入临床试验。但EVD疫情的严峻形式，推进其疫苗迅速进入临床试验。现已进入临床研究且最有前景的疫苗分别为黑猩猩腺病毒载体二价疫苗（cAd3-EBO）、黑猩猩腺病毒载体单价疫苗（EBL01）、VSV载体疫苗（rVSV-ZEBOV）和复杂腺病毒载体疫苗（MVA-BN Filo）。

3.1 cAd3-EBO疫苗 cAd3-EBO疫苗由英国葛兰素史克公司与美国国家过敏和传染病研究所（National Institute of Allergy and Infectious Diseases,NIAID）合作开发，为可表达EBOV-Z和EBOV-S型GP蛋白的二价疫苗，已于2014年9月初由美国马里兰州的国立卫生研究院进行Ⅰ期临床试验，主要测试疫苗的安全性。所有20名健康志愿者对疫苗的耐受性良好，并产生了抗EBOV抗体，其中接受较高剂量注射的志愿者产生的抗体水平较高；接近一半的志愿者体内产生了CD8+T淋巴细胞反应。该疫苗现已进入Ⅲ期临床试验阶段[40-41]。

3.2 EBL01疫苗 EBL01疫苗由NIAID与瑞士Okairos公司合作开发，为可表达EBOV-Z型GP蛋白的单价疫苗，已于2014年9月在英国进行Ⅰ期临床试验。59人免疫后，无严重不良反应出现，血清中抗体水平在第28天时最高，3个剂量组间抗体水平无明显差异。但CD8+T淋巴细胞反应不强，而CD8+T淋巴细胞被认为在控制病毒感染过程中起重要作用。2014年10月开始在西非马里首都巴马科市进行临床试验，已有91人接种疫苗。但由于人种差异，因此此疫苗尚须进一步研究[42]。

3.3 rVSV-ZEBOV疫苗 rVSV-ZEBOV疫苗由加拿大公共卫生署开发，美国NewLink与德国Merck公司生产，是将EBOVGP蛋白替换VSVG蛋白获得的重组疫苗，2014年由美国马里兰州的沃尔特里德陆军研究院开展Ⅰ期临床试验，以评估其安全性、适宜剂量以及可能产生的不良反应。但由于59名受试者中4名出现关节疼痛的现象，试验于2014年12月被叫停。通过分析原因和调整剂量后，于2015年1月恢复小剂量的临床试验。

3.4 MVA-BN Filo疫苗 MVA-BN Filo疫苗由美国强生公司与丹麦Bavarian Nordic公司合作开发，其利用基于Ad5sub360腺病毒的复杂腺病毒载体（cAdVax），同时表达多个基因，更适合制备多价疫苗。疫苗设计的长期目标是同时针对EBOV-Z和EBOV-S以及马尔堡病毒，但鉴于当前形势，公司将重点放在针对EBOV-Z的疫苗。2015年1月在牛津大学进行了小规模临床试验，72名志愿者已接受了第1次疫苗注射，主要验证人体对疫苗的反应，并计划在4月进行更大范围的人体临床试验。

此外，美国Novavax疫苗研发公司于2015年2月宣布，已在澳大利亚开展EVD疫苗早期人体临床试验，涉及230名健康志愿者。每名志愿者肌内注射首次免疫后21 d加强免疫1次，结果将在2015年第2季度获得。由中国人民解放军军事医学科学院与天津康希诺生物技术有限公司联合研制的重组EVD疫苗是全球第3个进入人体临床试验的EVD疫苗，该疫苗是针对2014年西非流行的EBOV-Z型构建的重组Ad5疫苗，且为冻干剂型，37℃条件下可保存2周，为全球首创，更适于在条件落后、冷链不完善的地区使用。该疫苗于2015年2月25日获得临床批件，进入临床试验阶段。

4 结 语

为了应对当前西非大规模暴发的EVD疫情，一些有前景的疫苗已处于临床试验阶段，其中，以腺病毒和VSV为载体制备的重组活载体疫苗发展最为迅速，现已通过了人体安全性试验。下一步可进行大规模临床试验，以进一步评价其安全性和有效性。其他种类的疫苗因为多种原因限制了其发展，但也提示疫苗的研究须综合考虑多方面因素，也为未来研制更有效的疫苗提供了参考和方向。有效的EVD疫苗不仅可控制疫情的发展，也可保护人们免遭病毒的感染。其中，对流行区的医护工作者进行的免疫策略须根据情况制定，不仅需要安全、有效，诱导可持续的保护性免疫反应，还须进行多次加强免疫。在这种情况下，由于存在预存免疫和抗载体的免疫，病毒载体为基础的疫苗应用于加强免疫时，效果就会减弱。因此，未来疫苗的发展，应考虑无载体疫苗。此外，在动物模型中验证疫苗的免疫原性和有效性时，疫苗诱导的免疫反应机制仍不完全明确，须进一步探索。例如，尽管针对GP的抗体水平与保护性有关，但也有研究指出，在具有有效保护作用的免疫反应中，高质量比高水平更为重要[36]。尽管不同的疫苗研制平台针对是否需要CD4+和CD8+T淋巴细胞有不同的意见，但大多数研究结果均表明，体液免疫是获得保护性免疫的关键。由此可见，在以EBOV为研究对象制备疫苗时，仍有许多工作须研究和完善。此次EVD疫情的暴发推进了全球对EBOV治疗制剂和疫苗的研究，促进了研究所、企业和政府间的国际交流与合作，并增加了研究经费，希望安全并有效的EVD疫苗能在短期内被研制出来。

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