委内瑞拉马脑炎疫苗研究进展

曹增国，王化磊，王丽娜，杨松涛，夏咸柱

委内瑞拉马脑炎（Venezuelan equine encephalitis,VEE）是一种由蚊媒传播的人兽共患病毒性传染病[1]，可引起人和马轻微发热，或导致严重的脑炎症状[2]。该病主要经蚊虫叮咬传播，还可经实验室感染[1]。也有研究证实气溶胶也是一种重要的传播途径[3]。该病的病原为VEE病毒（VEE virus,VEEV），是披膜病毒科甲病毒属的VEEV复合物中的一种。VEEV复合物由6种抗原上相关但又不完全相同的病毒组成，包括6种抗原亚型（Ⅰ～Ⅵ），Ⅰ和Ⅲ亚型又分别包括5个和3个变异株（即ⅠAB、ⅠC～ⅠF以及ⅢA～ⅢC）[1]。VEEV属于Ⅰ亚型，是最主要的致病因素[4]。VEEV囊膜中含有2种糖蛋白E1和E2，其中E2蛋白是主要的保护性抗原，可刺激机体产生中和抗体和血凝抑制抗体[4]。

我国虽然尚未发现VEE病例，但有些地区陆续分离到与其同属的东、西方马脑炎病毒或在人群和动物中检测到相关抗体[5-9]，且随着国际交流及人员往来的日益频繁，该病传入我国的风险大大增加。本病目前尚无特效药及疗法，疫苗免疫注射是控制该病的主要方法。目前尚无已获批的人用及兽用疫苗，但灭活疫苗C-84和弱毒疫苗TC-83已处于新药临床研究阶段[10-12]。本文综述了VEE疫苗的最新研究进展，旨在为该病的新型疫苗研究及防控策略制定提供参考。

1 灭活疫苗

最初制备的VEE疫苗是灭活疫苗，如福尔马林灭活疫苗C-84，动物实验证明其可刺激机体产生高效价的抗体[4]，在制备之初通过对志愿者试验证明了其免疫原性，但由于少数志愿者出现轻微或全身临床症状，提示仍存在一定的危险性[13]。灭活疫苗较低的免疫原性也在一定程度上限制了该类疫苗的发展[14]。由于C-84须多次免疫注射才能使中和抗体维持在有效保护水平，现基本已被弱毒疫苗所取代[4，10]。

2 弱毒疫苗

目前应用最多的为弱毒疫苗，如利用强毒株（Trd株）通过豚鼠胎儿心脏细胞连续传代研制的弱毒疫苗TC-83现已作为临床研究用新药被广泛应用于各类实验[15]。目前，TC-83主要应用于马的预防免疫中[16]，且已有很长一段时间的安全史。相关研究表明，TC-83不仅可以预防ⅠAB和ⅠC亚型VEEV感染，对ⅠD和ⅠE亚型也有一定的预防作用[4]。有研究利用反向遗传技术构建了野毒株Trd的全长cDNA感染性克隆，通过定点突变构建出弱毒疫苗株 V3526[1，17]。Fine 等[18]在灵长类动物中评估其免疫原性和神经毒性，证明其不仅可刺激机体产生免疫反应，且通过皮下途径注射后基本无神经毒性。马的免疫实验结果表明，当皮下注射102PFU的弱毒疫苗V3526时，即可对强毒株Trd的攻击产生有效保护[17]。Reed等[19]实验证明，弱毒疫苗株V3526不仅能使非人的灵长类动物如猴子产生对ⅠAB型病毒气溶胶感染的保护，而且还能产生对ⅠE型病毒感染的保护，从而提示V3526作为预防VEEV气溶胶感染的候选疫苗株的可能。但目前由于弱毒疫苗缺乏较好的免疫原性，并且可引起较为严重不良反应，而未能广泛应用于人类[10，20]。

3 重组活载体疫苗

重组活载体疫苗是把保护性外源基因插入到病毒或细菌基因组中，构建表达该外源基因的重组病毒或细菌，用该重组病毒或细菌免疫动物后可表达外源目的蛋白，刺激机体产生特异性免疫应答。腺病毒、痘病毒和疱疹病毒等是常用的病毒表达载体。Rosas等[21]将VEEV的结构基因插入到Ⅰ型马疱疹病毒（EHV-1）疫苗株RacH中，构建出重组病毒rH-VEEV，该重组病毒可使小鼠对致死性VEEV的攻击产生完全保护力，且在不产生中和抗体的情况下，该保护力主要与细胞毒性T细胞和VEEV特异性IgG抗体介导的免疫反应有关。Williams等[22]通过对重组腺病毒活载体疫苗的VEEV结构基因进行优化，通过增加密码子的使用率和提高信使RNA的水平，使蛋白表达水平得以提高。动物实验表明优化VEEV结构基因的重组腺病毒活载体疫苗，小鼠的特异性抗体水平提高10倍，亦可提高攻毒保护。研究还证明此疫苗可联合制备多联疫苗。Rossi等[23]将脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site,IRES）插入到VEEV弱毒株上，构建了1株不稳定的定点突变株，此毒株免疫小鼠可产生抗体，并对致死性气溶胶VEEV感染有一定的保护力，但是该突变株的免疫原性及保护效率有待进一步提高。在上述研究的基础上，Guerbois等[24]将亚基因组启动子应用于弱毒疫苗株TC-83中，并且使IRES仅调控VEEV衣壳蛋白的表达，构建了VEEV/IRES/C疫苗候选株。该疫苗株在小鼠体内连续传代仍可保持稳定的减毒性状，且对乳鼠的毒力更低，但对VEEV的强毒保护水平与TC-83弱毒疫苗株相当，该研究将有效的免疫原性和保护力同更低的毒力结合在一起，同时降低毒株在自然状态下传播的可能。

4 DNA疫苗

DNA疫苗又称基因疫苗，是指将编码某种蛋白抗原的重组真核表达质粒直接注射到动物体内，宿主细胞摄取后转录和翻译表达出抗原蛋白，此抗原蛋白能刺激机体产生非特异性和特异性2种免疫应答，从而起到免疫保护作用。Ljungberg等[25]研制出一种由质粒介导的以VEEV复制子为载体的DNA疫苗，即将现有的安全模式和加强了免疫原性的病毒复制子结合起来的新型基因工程疫苗，该DNA复制子可通过转入的VEEV 26S启动子表达高水平蛋白，并且在小鼠体内通过维持糖蛋白的细胞免疫，同时启动Th1型细胞免疫应答。该疫苗的使用剂量比其他疫苗小很多，从而说明其具有更好的免疫原性。Dupuy等[14]在体外重组了VEEVⅠAB、VEEVⅠE、穆坎博病毒、东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒的E1或E2蛋白基因，在巨细胞病毒启动子的介导下使嵌合基因表达多种蛋白。该研究通过定向分子进化制备了重组突变株DNA疫苗，从而刺激机体产生中和抗体。

5 病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）疫苗

VLPs 是由某种病毒的一个或多个蛋白的多拷贝自主包装形成的空衣壳结构，拥有与天然病毒或亚病毒粒子相同的抗原结构，能有效刺激机体产生体液免疫和细胞免疫应答，免疫原性好[26-27]。由于VLPs不含遗传物质，不能自主复制，所以具有良好的安全性。基于以上优点，军事医学科学院军事兽医研究所已开展针对VEEV VLPs疫苗的研究，并取得阶段性成果，为研制安全、高效的新型疫苗提供了技术储备。

6 小 结

国际交流的日趋频繁大大增加了VEE传入我国的风险，且我国部分地区已有东方马脑炎、西方马脑炎等与VEEV同属病毒所引起病例的出现，提示必须提高警惕。本着“关口前移，人病兽防”的原则，应从源头做好人兽共患病的防控工作，对外来动物疫病应严防严控[28]。目前，对于VEE的防控还主要依靠弱毒疫苗和灭活疫苗，随着分子生物学技术及基因工程技术的迅猛发展，新型疫苗的研发取得突破性进展，但多种前景良好的疫苗仍处于实验室研究阶段，要实现应用及商品化还有很长的路要走。随着研究的不断深入，VEE疫苗研究领域必将迎来新的阶段。

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