裂谷热疫苗研究进展

李月涛，郑学星，王翠玲，王化磊，杨松涛，夏咸柱

裂谷热（Rift Valley fever,RVF）是由裂谷热病毒（RiftValley fever virus,RVFV）引起的由节肢动物传播的一种急性、发热性人兽共患传染病。1930年，科学家Danbney等在肯尼亚裂谷的一次绵羊疾病暴发调查中首次分离到RVFV[1]。本病主要流行于非洲反刍动物，可引起怀孕动物流产及新生动物死亡；人类对本病普遍易感，严重者可引发死亡。

WHO将RVFV列为生物战剂之一，美国疾病预防控制中心和农业部将其列为A类病原体[2]，世界动物卫生组织将RVF列为A类法定报告动物疫病，我国《国家中长期动物疫病防治规划（2012—2020年）》将RVF列入重点防范的13种外来动物疫病。

据报道，1950—1951年肯尼亚暴发RVF疫情，造成10万只羊死亡，2万人感染[3]。1977年埃及暴发RVF疫情，25%～50%的羊、牛和骆驼感染，20万人感染，598人死亡，有些地区感染率高达35%[4]。

值得注意的是，2000年9月RVF越过红海，首次在传统疫区以外的地区——阿拉伯半岛（沙特阿拉伯和也门）出现疫情，增加了其向亚洲和欧洲其他地区传播和扩散的威胁[5]。

疫苗可以有效预防动物和人的RVF。本文就RVFV的病原学、流行病学及疫苗最新研究进展进行综述。

1 病原学

RVFV是一种RNA病毒，属布尼亚病毒科沙蝇病毒属，只有1个血清型。RVFV颗粒呈球形，颗粒直径为80～120 nm。病毒核酸为单股负链RNA，囊膜包围的3个核糖核蛋白复合体对应S、M和L基因组片段。L节段长6404 nt，反向编码RNA依赖的RNA聚合酶，也称为L蛋白。M节段长3885 nt，反向编码1个聚合蛋白，经翻译后剪切成2个大小分别为78 000 Da和14 000 Da的非结构蛋白（NSm）以及2个糖蛋白（GN和GC）。S节段长度为1690 nt，利用双向策略，反义链编码核衣壳蛋白（N），正义链编码一个非结构蛋白（NSs）[2]。

RVFV的各个蛋白在病毒复制和致病过程中的作用一直是研究的热点。N蛋白和L蛋白与病毒基因组结合形成核糖核蛋白复合物，然后进行基因组的转录和复制。糖蛋白对于布尼亚病毒在高尔基体内的成熟具有重要作用，GN和GC蛋白参与高尔基体的定位过程。研究表明，GN蛋白C端的48个氨基酸部位就是RVFV的高尔基体定位信号，而GC蛋白则通过物理作用与GN蛋白相结合从而定位于高尔基体。N蛋白是RVFV主要的免疫原，而病毒表面的GN和GC蛋白含有中和表位，均能刺激机体产生抗体，但只有GN能刺激机体产生中和抗体。核衣壳蛋白能刺激机体产生补体结合抗体。研究者利用单克隆抗体定位了GN糖蛋白含有的4个抗原决定簇，其氨基酸序列分别为Ⅰ（105－138aa）、Ⅱ（229－239aa）、Ⅲ（362－375aa）和Ⅳ（127－146aa）。表位Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ为中和表位，而表位Ⅲ为非中和表位。其中，抗原决定簇Ⅳ与构象有关，蛋白经SDS变性后不能与相应的单克隆抗体Ⅳ反应[6]。

2 流行病学

2.1 传染源 小绵羊、小山羊和小牛是本病的主要传染源。急性患者的血液和咽喉部有病毒存在，因此患者和其他动物宿主也可成为本病的传染源。感染动物的血液、体液、内脏和器官都具有传染性。

2.2 传播媒介 RVF主要是由蚊子传播，已知的可传播本病的蚊子种类超过20种，伊蚊和库蚊是本病流行的主要媒介，不同蚊种在不同地区被证明是优势媒介。RVF能被多种蚊子传播的特性使其很可能成为世界范围内重要的人兽共患病，而且绵羊和骆驼一旦感染发生高病毒血症，会更有效地传播本病。本病可以通过蚊虫的卵巢传播是其另一个关键的昆虫学特征。具有感染性的卵在土壤中能保持休眠状态几年，一旦有适合的环境条件，如大量的降雨、发生洪水或修建大坝，可导致蚊卵孵化，大量蚊虫滋生，新的感染性蚊虫会导致新一轮RVF的暴发。

2.3 易感对象 RVFV具有很广的脊椎动物寄生谱，反刍动物绵羊、山羊、牛和骆驼是其主要感染者。其他易感动物包括羚羊、马、猴、田鼠和野生啮齿类动物等。不同年龄的动物易感程度和病情不同。羔羊感染RVFV的死亡率可达90%，成年羊的死亡率低于10%，怀孕母羊感染后几乎100%流产。绵羊是RVFV的扩增宿主和二级传染源。人对RVFV普遍易感，可通过接触、处理感染性材料或蚊虫媒介叮咬感染。其中高危人群包括：①在本病流行地区露宿者；②流行地区的牧民、屠宰工作人员和兽医以及其他与被感染动物接触者；③在流行病地区旅游的游客。人感染后，有症状的患者表现为肝炎、视网膜炎、发热，或发展为综合征，如肝炎、出血热或脑炎，甚至死亡。本病病死率为1%左右。但近几次发生的流行中，病死率有上升的趋势[3]。

2.4 流行特点 本病呈地方性流行或暴发流行。多发于农村和牧区。一般于5月末或6月初开始发病，11月底至12月终止流行。人的发病通常在动物流产和发病后1～2周出现。本病有明显的职业性，牧民、兽医、屠夫和农民多见，RVFV研究人员发病率也较高。

3 RVFV疫苗

3.1 灭活疫苗 第1个以人用为目的RVFV的疫苗于1962年由Randall及其同事开发[7]。这种疫苗基于Entebbe毒株，该毒株于1944年从来源于乌干达的蚊子中分离出来。原Entebbe毒株在原代猴肾细胞增殖并通过福尔马林灭活。疫苗能诱导人体产生中和抗体，个体须多次免疫以达到可检测到的中和抗体滴度。疫苗效价在4～6℃条件下存储8个月以上无改变，据报道，1000人以上免疫后无不适的影响[7]。此后，该疫苗由南非国家药品生物研究公司（NDBR）生产，命名为NDBR－103疫苗，从1967年开始用于保护实验室工作者。

为提高疫苗生产标准，NDBR－103疫苗毒种被饰板纯化，并在二倍体恒河猴细胞上增殖，用于开发新疫苗。新疫苗由政府服务部门（TSI－GSD）和美国军队委托索尔克研究所生产，被称为TSI－GSD 200疫苗。Rusnak等[8]报道了TSI－GSD 200疫苗19年的免疫原性和安全性。结果表明，该疫苗耐受性良好，由于滴度下降均在首次疫苗接种后6～12个月，推荐首次疫苗接种后6个月加强剂量免疫。尽管TSI－GSD 200疫苗对实验室工作人员的保护非常有价值，但3次基础免疫和1次加强免疫的要求也表明，有必要研究一个更为有效的人用疫苗。

3.2 弱毒疫苗

3.2.1 Smithburn疫苗 19世纪40年代乌干达学者Smithburn通过RVFV在老鼠脑组织传代开发了Smithburn疫苗，这是第1个RVFV疫苗。产生的嗜神经Smithburn病毒目前仍在用作兽用疫苗，并且由南非Onderstepoort生物制品公司生产。该疫苗生产成本较低并且免疫接种1次就能产生长期免疫性，因此对流行地区RVFV的控制很有价值。然而，由于疫苗残余毒力能导致接种的怀孕动物流产和胎儿畸形，因此，Smithburn疫苗从未被考虑用于人类[9]。

3.2.2 Clone 13疫苗 Clone 13病毒株由74HB59毒株的噬斑纯化克隆而来，该毒株从中非共和国的一例患者身上分离[10]。该病毒在NSS基因含有大的（70%）缺失，在小鼠中高度衰减。然而Clone 13疫苗不是完全无毒力的，因为一项研究表明16只接种小鼠中有2只出现延迟性神经功能障碍和瘫痪[11]。绵羊[12]和牛[13]接种Clone 13疫苗的安全性和有效性研究表明，无任何不良反应发生，且免疫效力较高。

3.2.3 MP－12疫苗 1985年，Caplen等[14]证明通过连续诱变RVFV开发活的减毒疫苗是一种可行的方法。强毒株ZH548通过在诱变剂5－氟尿嘧啶的存在下不断传代，诱变病毒的毒力持续减弱，第12代后收获，被命名为MVP 12（后被命名为MP－12）。

2003 年，Morrill和 Peters[15]报道了一项 MP－12疫苗在恒河猴的致病性和神经毒性研究。MP－12的静脉内给药导致低水平的病毒血症，并且血清AST和ALT水平出现轻微的短暂升高，而GGT水平保持在正常范围内。不过，未出现临床症状。为了研究MP－12疫苗潜在神经毒性，分别通过肌内、下丘脑和脊柱内注射的途径接种猴子。在第1个实验中，5只猴子中的2只变得感觉过敏并发展成肌肉震颤。在第2个实验中，23只猴子中的2只出现左或右下瘫痪。综合2次实验研究得出结论：MP－12疫苗并非无害，但残留的病理病变较轻微，在实验中观察到的严重程度的顺序与17 d黄热病疫苗类似。

Morrill和Peters[16]还用恒河猴对疫苗的有效性进行研究。通过肌内注射接种疫苗并不会造成不良影响，尽管对对照组猴子攻毒未出现临床症状，但免疫避免了病毒血症的发生。随后的研究中发现，通过不同黏膜途径接种疫苗可以防止病毒血症发生。

对于MP－12疫苗的效力和安全性也进行了人体试验研究，有63名志愿者参与[17]。研究表明未发生严重不良反应，也未发现毒力回归。

3.3 基因工程疫苗

3.3.1 亚单位和核酸疫苗 Collett和Schmaljohn团队是最先基于Gn和Gc亚单位疫苗开发的开拓者，他们第一批表达了牛痘病毒和杆状病毒基因组的单个基因，并且研究了这些蛋白质的免疫原性。近年来，Kortekaas等[18]开发出一种基于Gn胞外结构域（GN－e）的亚单位疫苗，主要的目标是产生中和抗体。该GN－e蛋白与Stimune佐剂配制后在给小鼠和羊羔诱导单次接种后产生中和抗体，并保护羊羔避免出现病毒血症、发热和临床体征。

DNA疫苗的主要优点是容易生产，而免疫原性差是过去几十年一直困扰的主要问题，随着技术的提高有望尽快克服这一障碍。控制RVFV的实验性DNA疫苗已经开发出来，并且在啮齿类动物模型上获得了良好的结果。在绵羊上进行了第1个DNA疫苗实验，虽然实验结果建议须进一步改进其免疫原性，但也表明这是一个可行的方法。

3.3.2 载体疫苗 在过去的10年中，先后开发评估了几个人用的基于病毒载体的RVFV疫苗。近年来，基于痘病毒的改良安卡拉牛痘（MVA）疫苗和以痘病毒为基础的候选疫苗在狒狒上的实验表明，痘病毒载体疫苗具有安全性和免疫原性[19]。基于甲病毒复制子和复制缺陷型腺病毒载体CAdVax和ChAd－Ox1的试验性疫苗也已经开发出来。

Kortekaas等[20]开发了一种基于副粘病毒新城疫病毒（newcastle disease virus,NDV）的载体疫苗。单次接种产生的中和抗体保护羔羊未出现病毒血症和临床症状。这个疫苗被称为NDV－GnGc，已经开发用于家畜使用，该疫苗良好的免疫原性及安全性特征使其特别适合作为人的候选疫苗。NDV作为疫苗载体应用于人类的潜在用途已被广泛接受，因为人类不是NDV的天然宿主，最大限度减少了由于载体存在先天性免疫力导致接种失败的危险性[9]。

3.3.3 病毒样颗粒（virus－like particles,VLPs）疫苗 VLPs是由某种病毒的一个或多个结构蛋白自行装配而成的高度结构化的空心蛋白颗粒。与全病毒相比，VLPs作为疫苗具有独特优势：①安全性高，不含病毒核酸，无法自主复制，不存在基因重组或重配和毒力回复的可能；②表面抗原排列高度重复有序；③保持病毒抗原的天然构象，易被机体免疫系统识别；④允许外源蛋白的掺入；⑤能区别动物自然感染与免疫[21]。VLPs凭借本身的大小、电位等性质，能够有效激活抗原提呈细胞及B淋巴细胞[22－23]，既可通过主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）－Ⅱ类分子途径又可通过MHC－Ⅰ类分子途径进行加工提呈，从而诱导强烈的体液免疫和细胞免疫[24－26]。这使得在无病毒复制条件下树突状细胞能有效地诱导细胞毒性T淋巴细胞反应[27]。因此，某些VLPs既能激活辅助性T淋巴细胞又能激活细胞毒性T淋巴细胞反应，而且VLPs可以直接诱导树突状细胞成熟，从而对共刺激分子及细胞因子进行正调控以激活CD8+T淋巴细胞[28－29]。目前，有2种人用VLPs疫苗批准上市，分别是英国葛兰素史克公司生产的乙型肝炎疫苗和二价人乳头瘤病毒疫苗以及美国默克公司生产的乙型肝炎疫苗和四价人乳头瘤病毒疫苗[30]，其他多种病毒VLPs疫苗正在研发或处于临床试验阶段[31]。由此显示了VLPs作为疫苗的广阔应用前景。

RVFV VLPs是一个不被复制的病毒粒子，它由病毒的被膜G1、G2及N蛋白组成，并且吸附到细胞受体上，就像感染了RVFV。在VLPs吸附到细胞受体后，病毒的被膜蛋白在内吞溶酶体内被消化，然后MHC－Ⅱ提呈抗原，这证明VLPs的抗原稳定性和免疫原性超过了可溶性蛋白[32]。Näslund等[33]共表达了 RVFV 的 N、L、G1、G2、78 ku NSm，用 RVFV VLPs免疫老鼠产生的中和抗体滴度是1∶250～1∶1250，被免疫的老鼠在RVFV ZH548病毒株的攻击中成功获得保护。实验表明，基于VLPs的实验性疫苗（种）在小鼠模型上具有很好的免疫原性，甚至在没有佐剂存在时也可诱导产生高水平的中和抗体。

4 结 语

总之，每种RVFV疫苗都有自身的优缺点。灭活疫苗虽然安全，但须重复增加剂量；弱毒活疫苗虽然免疫原性较高，但存在毒力回归的生物安全隐患。近年来，运用反向遗传技术生产的RVFV疫苗具有高效性和稳定性。基因工程疫苗免疫安全，但由于进行特异性动物模型实验有限，免疫的途径、剂量、毒株的筛选、中和抗体的滴度和测定有待确定。VLPs疫苗以其独特的优势具有良好的发展前景，但其在规模化生产及如何降低生产成本方面还须进一步改进。

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