拉沙热疫苗研究进展

闫飞虎，王化磊，冯娜，杨松涛，夏咸柱

拉沙热疫苗研究进展

闫飞虎，王化磊，冯娜，杨松涛，夏咸柱

拉沙热是由拉沙病毒（Lassa virus,LASV）引起的一种急性传染病，主要由啮齿类动物传给人。西非是拉沙热最主要的流行区，该地区每年有几十万人患病，数千例死亡。由于LASV的高致病性，被列为潜在生物战剂，当前无获批的拉沙热疫苗。研究表明传统的灭活疫苗免疫保护效果不理想，LASV基因重组的复制增殖型病毒载体疫苗、复制缺陷型病毒载体疫苗和DNA疫苗等新型疫苗显示较好的发展前景。但是这几种新型疫苗仍处于临床预试验阶段或临床试验阶段。

拉沙热；拉沙病毒；疫苗

拉沙热（Lassa fever,LF）是由拉沙病毒（Lassa virus,LASV）引起的急性传染病，于20世纪50年代首次发现于非洲尼日利亚东北地区的拉沙镇，直到1969年才分离出病毒。LF临床表现差异很大，大多数人感染后无明显症状，少数严重感染后可引发肝、脾、肾、脑等多器官损伤及出血性休克等[1]。LF主要在西非（几内亚、利比里亚、塞拉利昂和尼日利亚）流行，发病率和病死率相当高，西非每年大约有250 000例感染LASV，5000例死亡[2]。人可以通过接触被LASV感染的啮齿动物的分泌物、排泄物、组织及血液而感染，人与人之间传播主要通过消化道或呼吸道。由于LASV的高致病性，被列为A类潜在生物战剂[3]。

LF的致死率尽管不如马尔堡出血热和埃博拉病毒病高，但感染范围更广，被视为严重威胁人类的疾病。为应对LF威胁，早在20世纪80年代科学家即着手开展疫苗的研究，并在猪及非人的灵长类动物中免疫，取得良好效果。

1 传统疫苗

1.1 弱毒活疫苗LASV被分离出后不久，Kiley等[4]用与LASV亲缘关系密切的沙粒病毒属的活Mopeia病毒免疫猴，攻毒结果提示该免疫猴能抵抗LASV的致死性攻击。Mopeia病毒可能是LF理想的“天然”弱毒活疫苗候选者，但无论过去还是现在因涉及弱毒株的使用安全问题，而阻碍了疫苗研发[5-6]。

最近，Zapata等[7]研究的减毒疫苗候选株ML29初显成效，它是LASV与Mopeia病毒的重配体。豚鼠和狨猴免疫接种ML29后均可诱导中和抗体的产生，并可抵抗LASV的致死性攻击。进一步研究表明：该疫苗在非人的灵长类动物中也具有很好的免疫效果，其在体内的稳定性高，不会出现毒力返强现象。因此，ML29是一种有发展前景的LF减毒疫苗候选。

1.2 灭活疫苗灭活LF疫苗曾用恒河猴实验，结果显示无保护作用[8]。灭活LASV的动物虽然产生了抗LASV抗体，但是在攻毒后免疫动物全部死亡，检测发现其血清病毒水平与未免疫对照猴相同。该结果提示免疫保护还应依赖于细胞免疫应答。

有研究报道用灭活LASV免疫可以诱导狒狒有效对抗0.4蚀斑形成单位的LASV攻击[9]。尽管当前LASV灭活疫苗的前景不容乐观，但是新型佐剂（如ISCOMATRIX）可显著增强免疫机体的特异性体液免疫和细胞免疫应答，可能增强灭活疫苗的免疫保护效能[10]。

2 重组活载体疫苗

2.1 复制增殖型病毒载体疫苗第一个LASV基因重组疫苗是利用重组的牛痘病毒来表达LASV Josiah毒株的核蛋白、表面糖蛋白和跨膜蛋白。恒河猴免疫保护实验显示：同时表达这3种蛋白的重组牛痘疫苗，或者同时表达表面糖蛋白和跨膜蛋白的重组牛痘疫苗免疫的动物能有效对抗LASV攻击，但是单独表达核蛋白的重组牛痘疫苗却不能诱导有效的免疫保护[3]。尽管牛痘病毒载体疫苗的研究显示其在诱导抗LASV感染中的良好作用，但是活牛痘病毒载体疫苗对免疫抑制人群无效，此外先前接种的其他牛痘病毒载体疫苗（如天花疫苗）可能会干扰LASV基因重组牛痘病毒载体疫苗的免疫作用[11]。

另外2种具有强复制子的病毒载体也处于实验阶段。一种以水泡性口炎病毒为载体[3]，另一种以黄热病毒做载体[12-13]。通过反向遗传技术，用LASV的糖蛋白基因取代水泡性口炎病毒的表面糖蛋白基因，拯救获得表达LASV糖蛋白的重组病毒[14]。结果显示此类疫苗对猴安全，免疫猴均能产生适度的特异性IgG抗体和低水平的中和抗体；LASV攻击后，免疫猴的感染症状显著轻于非免疫猴[3]。

黄热病病毒重组LF疫苗用减毒黄热病病毒疫苗株YFD-17D构建。在过去的70年中，YFD-17D免疫接种过几百万人，显示出高安全性和良好免疫原性，被广泛应用于嵌合疫苗的构建。如能用其成功构建一种既抗黄热病又抗LF的嵌合疫苗，则是非洲人民的福音。但是，采用YFD-17D与亲缘关系较远的LASV进行嵌合很困难。在起初的探索中，将LASV的糖蛋白基因嵌合到黄热病病毒中，并同时保留黄热病病毒的膜蛋白基因。尽管该嵌合病毒构建成功，豚鼠实验显示其能诱导有效的抗LASV免疫，但是该嵌合病毒复制率很低，且在细胞中传几代后变得不稳定[12，15]。为了获得复制率高且更加稳定的嵌合病毒，仅表达LASV表面糖蛋白或跨膜蛋白的嵌合病毒得到研发，尽管该嵌合病毒的复制率和稳定性均有提高，但是免疫保护性不理想[12]。

2.2 复制缺陷型病毒载体疫苗迄今，2种不同的复制缺陷型疫苗研究已报道：委内瑞拉马脑炎病毒复制子[16]和病毒样颗粒[17]。委内瑞拉马脑炎复制子疫苗系统由几种RNA构成，这几种RNA由3种不同的cDNA在体外产生，其中1种可编码复制子（即委内瑞拉马脑炎复制酶和LASV的囊膜糖蛋白前体蛋白基因或核蛋白基因），另外2种编码委内瑞拉马脑炎的包膜蛋白和衣壳蛋白。用这几种RNA共同感染细胞可产生委内瑞拉马脑炎病毒样颗粒，这些颗粒包含LASV复制子，且这些颗粒可从细胞培养物上清中纯化获得，该纯化颗粒可感染细胞或动物。因为无辅助RNA提供包装成分，所以这种复制仅发生1次，而没有其他感染性颗粒的产生。豚鼠动物实验表明：连续免疫3次后在豚鼠体内未检测到中和抗体，只检测到了一些非中和抗体，攻毒后部分免疫豚鼠出现病毒血症，但均未出现临床症状，非免疫豚鼠则全部死亡。提示特异性细胞免疫应答在抗病毒感染中起重要作用[16]。

另外一种委内瑞拉马脑炎复制子疫苗是用同一RNA表达LASV糖蛋白和埃博拉病毒表面糖蛋白。动物实验表明这种疫苗可诱导豚鼠产生免疫对抗LASV或埃博拉病毒的致命性攻击，但是再次遭受LASV攻击后免疫豚鼠会出现病毒血症。

另一种是不具有自主复制能力的病毒样颗粒，与全病毒相比病毒样颗粒作为新型疫苗具有独特优势：不能复制，安全性高；病毒样颗粒凭借其本身的大小和电位等，能够有效激活抗原提呈细胞及B细胞，既可通过组织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）-Ⅱ类分子途径又可通过MHC-Ⅰ途径被加工提呈，从而诱导更有效的体液免疫和细胞免疫应答。LASV样颗粒由质粒转染细胞表达的LASV糖蛋白、核衣壳蛋白和小蛋白组装而成。沙粒病毒的小蛋白是病毒的基质蛋白，它与病毒的出芽生殖有关，相关研究表明其可使形成的病毒样颗粒从感染或转染成功的细胞中释放出来[17]。形成的病毒样颗粒形态上与真实的LASV相似，但其免疫保护性尚有待证实。

3 DNA疫苗

在重组DNA疫苗的构建中最重要的是质粒DNA。当质粒进入宿主细胞之后，它利用宿主细胞内的酶和原料进行转录并翻译出目的蛋白，类似原始的病毒进入细胞后生产自己蛋白质的过程。采用不同的方法（如基因枪技术和电穿孔技术）将DNA疫苗注入动物体内，让DNA穿过细胞膜进入细胞内诱导机体产生更有效的免疫应答。

一种表达LASV核蛋白基因的DNA疫苗可在小鼠体内诱导特异性CD8+T淋巴细胞应答，且可以抵抗另外2种沙粒病毒的攻击（淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒和伯钦特沙粒病毒）[18]。Grant-Klein等[19]将LASV糖蛋白基因重组DNA疫苗通过真皮内电穿孔注射方式免疫豚鼠和短尾猴，可使100%的免疫动物抵抗LASV的致死性攻击。

4 LF疫苗可行性及挑战

尽管LF是一种急性传染性疾病，但尚无证据显示幸存者有二次感染发生，提示采用灭活病毒疫苗接种预防是可行的[20]。但是，由于此病毒的高致病性，灭活疫苗生产中的病毒大量繁殖必须在生物安全4级实验室里进行。另一个瓶颈是LASV的基因型多样性，基因序列的系统进化分析将54株LASV分为4种血清型，菌株核苷酸水平变异高达27%，氨基酸水平变异高达15%[21]。尽管这些变异对菌株交叉免疫反应的影响还不为人知，但用某一种血清型LASV作灭活疫苗可能不能诱导机体产生抗另一种血清型病毒的有效免疫。

抗LASV保护性免疫应答不仅与体液免疫有关，更可能与细胞免疫有关。尽管人和非人灵长类动物感染LASV会产生高水平特异性抗体，但是这些抗体都不是中和抗体，而从LF康复患者和动物血清中检测到的是低水平中和抗体[20]。研究发现LASV感染后幸存的短尾猴比死亡短尾猴的特异性T细胞应答发生更早、更强，能产生更多的细胞毒T细胞；病情严重的短尾猴细胞免疫应答受到严重抑制，死亡短尾猴仅检测到缓慢发生的低水平T细胞应答[22]。这些提示特异性细胞免疫在抗LASV感染中有十分重要的作用。

基因工程疫苗是今后LF疫苗研发的热点。随着分子生物学技术的迅猛发展，研发能诱导特异性体液和细胞免疫应答对抗所有血清型LASV的新型疫苗是可能的。多种研发前景良好的LASV基因工程疫苗已进入实验室或临床前研究阶段，但这些疫苗的实际应用还有很长的路要走。

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（2015-02-08收稿 2015-03-17修回）

（责任编委 貌盼勇 本文编辑 陈玉琪）

Recent advances in the development of Lassa fever vaccines

YAN Fei-hu,WANG Hua-lei,FENG Na,YANG Song-tao*,XIA Xian-zhu*
Laboratory of Virology,Institute of Military Veterinary Medicine,Academy of Military Medical Sciences,Key Laboratory of Jilin Province for Zoonosis Prevention and Control,Changchun,Jilin 130122,China
*Corresponding author.Yang Song-tao,E-mail:yst62041@163.com;Xia Xian-zhu,E-mail:xiaxzhu@cae.com

Lassa fever is an acute viral disease caused by Lassa virus(LASV).The virus ismainly transmitted to humans by a rodent reservoir,Mastomys natalensis.The infection is endemic in West African countries,resulting in hundreds of thousands of cases annually,and causing approximately thousands of deaths each year.Due to its high pathogenicity,LASV is recognized as a potential agentofbio-warfare.Currently,there are no licensed vaccines for Lassa fever.Studies have shown that the vaccine prepared by in-activated LASV is not ideal for eliciting a protective immune response.Recently,several promising vaccine candidates against Lassa fever have been developed,such as replication-competent virus-vectored vaccines,replication-deficient virus-vectored vaccines and DNA vaccines.However,these novel typesofvaccine candidatesagainst Lassa fever remain to be pre-clinically and/or clinically evaluated.

Lassa fever;Lassa virus;vaccines

R512.99

A

1007-8134(2015)02-0122-03

国家科技支撑计划（2013BAD12B04）

130122长春，军事医学科学院军事兽医研究所病毒学研究室吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室（闫飞虎、王化磊、冯娜、杨松涛、夏咸柱）；130118长春，吉林农业大学动物科学技术学院（冯娜）

杨松涛，E-mail：yst62041@163.com；夏咸柱，E-mail：xiaxzh@cae.cn