西方马脑炎疫苗研究进展

王 超，金宏丽，王化磊，杨松涛，夏咸柱

西方马脑炎（western equine encephalitis,WEE）是由西方马脑炎病毒（western equine encephalitis virus,WEEV）感染引起，经蚊虫传播的急性人兽共患病毒性疾病。该病具有传染性强、发病率及病死率高等特点。WEEV于1930年首次从美国加州默克郡的病马脑内分离，目前WEE主要分布于北美洲的加拿大、美国以及南美洲的巴西、阿根廷、墨西哥、秘鲁、智利和乌拉圭等国。此病在北美呈地方性流行，以不规则的间隔时间在马和人群中流行[1]。我国于1990年首次从新疆维吾尔自治区乌苏县的赫坎按蚊和博乐县的全沟硬蜱中分离到WEEV[2]。吕新军等[3]在我国青海省、甘肃省、黑龙江省、河南省、湖北省、安徽省、湖南省、宁夏回族自治区及新疆维吾尔自治区进行人体血清调查，发现除宁夏回族自治区、黑龙江省和湖北省未发现WEEV抗体阳性血清外，其余地区均存在WEEV抗体阳性血清，WEEV抗体阳性率达到2.71%。最近几年我国多地出现不明原因脑炎病例，疑与WEEV有关，提示WEEV存在于我国，且有暴发流行的可能。

因WEEV感染人和马后可导致极其严重的负面影响，受感染的人和马也存在跨国传染的可能性[4]，在全球引起了广泛关注，发生疫情后必须向世界动物卫生组织申报[5]。此外，WEEV被视为一种潜在的生物战剂（生物恐怖剂）[6-7]。目前WEE尚无获批疫苗或有效抗病毒药物，研发有效疫苗用于相关人群的免疫预防显得尤其重要。本文就疫苗研究进展进行综述。

1 灭活疫苗

目前，基于福尔马林灭活WEEV制备的灭活疫苗是一种试验中新药，仅适用于马和实验室工作人员的预防免疫[8]。长期试验表明：3次免疫后仅有50%的个体产生了有效免疫应答，且免疫后1年仅有20%的个体仍存在特异性免疫力，因此易感人群须每年进行加强免疫[9]。虽然该灭活病毒疫苗免疫效果良好，但是生产过程中病毒的大量繁殖须在生物安全3级实验室进行，此过程存在操作人员被WEEV感染的风险，导致疫苗生产成本居高不下，因此该疫苗的应用受到限制[5]。

2 减毒活疫苗

目前尚无减毒活疫苗获批上市，WEEV弱毒株的筛选处于研究阶段。有报道利用反向遗传技术，将WEEV的全长cDNA进行定点突变，拯救获得了减毒的突变毒株（WE2102和WE2130）。动物实验结果表明，与母本毒株相比，减毒株在蚊体内的复制和传播能力明显降低，免疫1日龄小鸡2周后以WEEV强毒株进行攻击，未出现病毒血症，WE2102和WE2130可作为减毒疫苗候选株[10]。

曾有一种与WEEV同属的委内瑞拉马脑炎病毒的减毒疫苗获批在人和马中使用，但临床应用结果表明，尽管该疫苗能够诱导机体产生持久的保护性免疫，但近40%的疫苗接种者出现不同的不良反应。此外，考虑存在神经毒性等不安全因素，该减毒疫苗在美国已停止使用[11]。

3 亚单位疫苗

Das等[12]利用大肠杆菌表达WEEV的E1蛋白，该重组蛋白免疫小鼠后可产生较强的特异性细胞免疫和体液免疫应答，但同源WEEV攻击的保护率仅为25%，且对异源病毒株的攻击无保护力。此外，该研究组又采用大肠杆菌表达了WEEV的E2蛋白，尽管E2蛋白免疫小鼠的同源WEEV攻击保护力略高于E1蛋白，但整个实验结果与E1蛋白的结果无显著差异[13]。

近来，也有研究尝试采用杆状病毒表达系统表达WEEV糖蛋白以制备WEE亚单位疫苗。Toth等[14]分别构建了表达不同WEEV糖蛋白（整个E1蛋白、E1蛋白结构域、E26KE1多聚蛋白前体和E2-E1嵌合蛋白）的重组杆状病毒，并同时研究不同杆状病毒启动子对诱导目的蛋白表达的影响。结果表明，目的蛋白的性质和启动子的类型均会影响重组蛋白表达的产量和质量。采用杆状病毒表达系统制备的这些重组蛋白的免疫保护效果尚待动物实验进行评价。

4 嵌合体疫苗

近年来，辛德毕斯病毒（sindbis virus,SINV）被成功用作表达高致病性甲病毒属脑炎病毒结构蛋白的表达载体。Atasheva等[7]利用SINV载体首先构建了第一代嵌合体病毒SIN/CO92，其结构蛋白来自WEEV CO92-1356株，非结构蛋白均来自SINV AR339株。嵌合重组病毒可在哺乳动物和蚊虫细胞内高效复制，并对6周龄小鼠无致病性。动物免疫实验显示：高剂量（5 log10PFU）的SIN/CO92嵌合体病毒免疫小鼠能有效抵抗致死剂量的WEEV攻击，低剂量（≤4.5 log10PFU）嵌合体病毒免疫时其保护率为50%～60%。此外，Atasheva等[7]还构建了第二代嵌合体病毒IN/SIN/McM和SIN/EEE/McM，其结构蛋白来自WEEVMcMillan株，但其编码RNA结合结构域的衣壳蛋白N-末端则分别来自SINV或东方马脑炎病毒（eastern equine encephalitis virus,EEEV）FL93-939株，非结构蛋白均来自 SINV AR339株。安全性和免疫原性实验结果显示，部分小鼠在SIN/SIN/McM嵌合体病毒免疫后发病并死亡，提示该嵌合体病毒毒力强；与此相反，SIN/EEE/McM嵌合体病毒则呈现出高免疫原性和弱毒性，而且WEEV攻击后的免疫小鼠保护率为100%。

Schoepp等[15]采用反向遗传技术，拯救获得了重组WEEV和EEEV的嵌合体病毒。该嵌合体病毒基因组5'末端的2/3来自于WEEV，编码非结构蛋白；3'末端的1/3来自于EEEV，编码结构蛋白。与母本病毒（WEEV和EEEV）相比，该嵌合体病毒的毒力显著降低，其免疫小鼠后可有效抵抗致死剂量的EEEV攻击，但不能抵抗致死剂量的WEEV攻击。

5 重组活载体疫苗

5型人腺病毒（human adenovirus type 5,HAd5）载体也被应用于WEE新型疫苗的研究。Wu等[16]利用HAd5载体构建了表达WEEV 71V-1658株E3-E2-6K-E1结构蛋白的重组病毒Ad5-WEEV。小鼠实验结果表明：Ad5-WEEV免疫小鼠1次不仅可100%抵抗致死剂量的同源WEEV（71V-1658株）攻击，还可有效抵抗致死剂量的异源病毒（CBA87）攻击。此外，1次免疫后13周，免疫小鼠仍具有有效抵抗力。Ad5-WEEV可作为WEE暴发或WEEV生物袭击时的候选应急疫苗[6]。然而，作为重组活载体疫苗，人体内已经存在的腺病毒抗体产生的抗载体免疫以及腺病毒本身的安全性仍须进一步评价。

6 DNA疫苗

Nagata等[17]制备了表达WEEV 71V-1658株结构蛋白（C-E3-E2-6K-E1）的DNA疫苗pVHX-6。4次免疫后，同源病毒株攻击时免疫小鼠受到100%保护，然而该疫苗对异源病毒株的攻击仅能提供50%～62%的保护。进一步研究表明，该DNA疫苗免疫不能诱导机体产生高水平中和抗体，但能诱导产生较强的E1和E2抗原特异性T细胞免疫应答。

为进一步研究pVHX-6的哪一种编码蛋白与保护性免疫相关，Gauci等[18]构建了pE3-E2-6K-E1、pE3-E2和p6K-E1 3种不同的DNA疫苗。动物实验结果显示：3次免疫后，p6K-E1、pE3-E2-6K-E1和pVHX-6免疫小鼠抗同源病毒株的保护率为100%，当用异源病毒株CBA87攻击时仅部分免疫小鼠受保护；用异源病毒株Fleming攻击时，pE3-E2-6K-E1免疫小鼠的保护率为100%，pVHX-6免疫小鼠为50%，p6K-E1免疫小鼠为0。此外，pE3-E2免疫小鼠对WEEV同源病毒株或异源病毒株的攻击均无保护力。其免疫保护缺失的原因可能是因为6K基因片段的缺失，而这个基因片段对于蛋白的正确折叠起着至关重要的作用。

7 小 结

随着免疫学和分子生物学技术的飞速发展，研究者不断尝试开发新型WEE疫苗，且许多疫苗已在小鼠模型中被证实安全有效，在下一步进入人体试验前可先用马模型进行评价。近年来，WEE不仅在北美广泛传播，而且正在欧洲国家逐步扩散，加之存在的WEE跨国传播和我国存在WEE暴发流行的可能性，我国WEE新型疫苗的研究迫在眉睫。

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