隐孢子虫病诊断和治疗研究进展

刘彩霞，赵继学，尹继刚

隐孢子虫是细胞内寄生原虫，主要感染宿主小肠上皮细胞，可引起人兽共患隐孢子虫病。该病主要在隐孢子虫的卵囊阶段通过粪-口途径传播，饮用受污染的水、食入不干净的食物或是直接接触感染的人或动物均能导致感染。

隐孢子虫病的临床症状常为霍乱样腹泻，免疫功能正常的宿主表现为肠胃不适、腹泻、腹痛、体液大量丢失及发热等，一般发病后7～14 d 可自愈。但是对于免疫功能低下的宿主，尤其是未断奶的动物和营养不良的儿童，此病可能引起持续性腹泻，甚至导致死亡。隐孢子虫病的治疗方法有限，目前尚无可用于预防的疫苗，发病率在世界范围内呈逐年上升态势，大规模隐孢子虫病的暴发也引起了公众对该病的广泛关注。本文对隐孢子虫病的实验室诊断以及治疗研究进展作一综述。

1 实验室诊断

及时准确的诊断对于有效管理感染人群，制订相关的预防措施尤为关键。根据所检测样本的不同，隐孢子虫病的实验室诊断方法包括直接检测虫体（或抗原/核酸）和间接检测虫体2 个方面。

1.1 直接检测虫体（或抗原/核酸）

1.1.1 检测粪便中的隐孢子虫卵囊 是最常规的一种检测手段，常用方法有如下几种。

1.1.1.1 抗酸染色法 该法是最常规的一种检测方法。微小隐孢子虫卵囊为圆形，大小为4～6 μm，内含4 个子孢子，有一厚壁卵壳。通过抗酸染色很容易辨别。常用的染色方法有改良金胺酚抗酸染色法、萋-尼氏抗酸染色法及番红染色法等。为了提高检出率，镜检之前须要对粪便样本进行富集，在给出阴性结论之前至少要检测3 份样本。

抗酸染色法的特异度和灵敏度均低于直接免疫荧光法（direct immunofluorescence assay,DFA）、聚合酶链反应法（polymerase chain reaction,PCR）和酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）。该方法的优点在于能够检测到当前感染，而PCR 和ELISA 不能区分当前感染和既往感染。该方法还能检测到其他原虫，如环孢子虫和等孢球虫等。缺点在于对人员的要求较高，而且需要必要的设备，如显微镜。

1.1.1.2 DFA 即隐孢子虫卵囊与荧光标记的单克隆抗体反应后用荧光显微镜观察。该方法与抗酸染色法相比，具有很高的灵敏度和特异度，被很多实验室认为是诊断的“金标准”。须要注意的是，粪便样本在检测前须经过福尔马林灭活和浓缩处理。检测食物、水和环境样本时，可能会与藻类发生交叉反应，须要通过相差显微镜观察卵囊内容物和子孢子以及通过细胞核染料来加以确认。该方法适用于暴发疫情监测。该方法的缺点在于不能区分感染虫种和基因型。Reboredo-Fernández 等[1]收集了32 份无脊椎动物样本，用DFA 检测到含有卵囊阳性率为12.5%。

1.1.2 检测小肠液或肠组织活体组织标本中的隐孢子虫 过去由于抗酸染色法和抗原检测方法不成熟而采用该法，现在已不常用。由于肠道寄生虫感染的不均一性，通常会遇到假阴性的情况。

1.1.3 检测粪便中的隐孢子虫抗原

1.1.3.1 ELISA 该方法不须要在检测前富集样本，灵敏度高于抗酸染色法，自动化程度高，可在短时间内对大量样本进行筛查。而且对操作人员的技术要求低。用该方法检测，必须设立对照。

1.1.3.2 侧流免疫层析法（immunochromatographic lateral flow,ICLF） ICLF 试纸条是由样品垫结合物释放垫、检测线、对照线、硝酸纤维素膜和吸收垫组成。ICLF 是一种快速检测方法，对实验条件要求较低，操作步骤简单，但是与其他免疫学检测方法相比灵敏度较低。Chalmers 等[2]用荧光定量PCR 检测259 份粪便样本，确定了152 份阳性样本，包括80份人隐孢子虫（C.homnis）、68 份微小隐孢子虫（C.parvum）、2 份猫隐孢子虫（C.felis）、1 份泛在隐孢子虫（C.ubiquitum）和1 份火鸡隐孢子虫（C.meleagridis）样本，再用于测试其他检测方法，其中ELISA 的灵敏度为91.4%，DFA 的灵敏度为92.1%，而免疫荧光显微镜法的灵敏度为97.4%，ICLF 灵敏度为84.9%。本法适合于对AIDS 患者、儿童和暴发流行疫情的检测或监测。通常ELISA 和ICLF 检测隐孢子虫时，也可以同时检测其他相关病原（如贾第虫和溶组织内阿米巴）[3-4]。

1.1.4 分子生物学方法

1.1.4.1 PCR 该法若用于检测粪便中的卵囊，粪便须储存于重铬酸钾或冻存以检测DNA。防腐剂能够抑制PCR 反应，因此必须洗去，但如果防腐剂进入卵囊，将影响PCR 检测。常用的靶基因有18S 核糖体DNA、卵囊璧蛋白基因和糖蛋白GP60 基因等。其中巢氏PCR 和荧光定量PCR 具有更高的灵敏度。荧光定量PCR 可以对样品中的卵囊数定量，从而确定样本对环境的污染程度[5]。PCR 不仅可以作为检测病原体核酸的手段，还可以作为区分不同虫种和同一虫种内不同基因型的工具，这在暴发疫情的传染源追溯上具有重要意义。由于DNA 稳定性好，以DNA 为模板建立的PCR 不能确定样本中虫体的活力和感染特性，而以RNA 为模板的反转录PCR（reverse transcription-PCR,RT-PCR）可以弥补这一缺点。

1.1.4.2 RT-PCR 由于RNA 在虫体死后很快降解，因此RT-PCR 可以评价虫体的活力和感染性。最常采用的靶基因是热休克蛋白70 基因，在虫体受到热应激时，该基因高效稳定表达，这样提高了检测的灵敏度，还能准确定量虫体的活力和感染性。

1.1.4.3 环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP） 该技术的灵敏度高于巢氏PCR。研究显示在巢氏PCR 检测为阴性的样本中，有约1/3 的样本为LAMP 阳性[6]。因此，该方法适用于检测健康人或动物的低水平感染。

1.2 间接检测虫体

1.2.1 诊断方法 包括ELISA、蛋白质印迹法（Western-blot）和多重微珠免疫法（multiplex microbead immunoassay,MIA）等。

1.2.1.1 ELISA 是最常用的方法，其操作简便易行，适用于大规模流行病学监测。Lee 等[7]从位于韩国4 个不同地区的医院采集微小隐孢子虫病患者血清，制备粗抗原用ELISA 对隐孢子虫感染率进行了调查。检测的2394 份样本中，特异性IgG、IgM 和IgA 抗体阳性率分别为34%、26%和56%。

1.2.1.2 Western-blot 是筛查和诊断隐孢子虫病的有效方法，很多实验室以该方法作为“金标准”。Al-Braikan 和Al-Rabia[8]收集了130 份成年人（18～30 岁）血清样本，制备15～17 kDa 与27 kDa 隐孢子虫抗原，用Western-blot 分析隐孢子虫的感染情况。15 kDa 抗原阳性率为8.5%，27 kDa 抗原阳性率为23.8%，34.6%人血清样本与2 种抗原都发生反应。Shayan 等[9]收集437 份牛血清样本，其中犊牛264份，牛173 份，用p23 基因扩增后连接pGEX-5X-2载体表达重组蛋白质用于识别血清抗体，Westernblot 检测结果显示，2 组样本感染微小隐孢子虫血清阳性率分别为33%和37%。以上结果说明Western-blot 可用于隐孢子虫病的检测。该方法的缺点在于所需抗原和时间较多，不适合大规模的流行病学调查。

1.2.1.3 MIA 该法是近年来新开发的免疫学检测技术，具有比ELISA 更高的灵敏度（因为抗原与微珠结合更容易被抗体捕获），具有所需样本体积小、省时省力和成本低的优点，弥补了ELISA 的不足，而且容易准确定量。Du 等[10]用重组蛋白Cp23、SA35和SA40 与微粒子偶联，建立MIA 用于检测隐孢子虫特异性抗体，结果显示此方法灵敏度较高，且发现儿童新近感染率高，而成人的既往感染率高。

1.2.2 诊断抗原 包括天然虫体抗原和重组抗原。

1.2.2.1 天然虫体抗原 隐孢子虫全虫抗原是血清学检测方法中广泛应用的诊断抗原。Kaushik 等[11]纯化隐孢子卵囊，超声处理后反复冻融制备全虫抗原，通过建立ELISA 比较感染隐孢子虫的HIV 阳性和阴性患者血清中特异性IgG、IgM 和IgA 抗体与微小隐孢子虫可溶性全虫抗原的免疫反应。结果显示，全虫抗原检测特异性抗体IgG 的灵敏度比IgM 和IgA 抗体高，并且证明隐孢子虫特异性抗体反应可能与疾病的症状没有必然联系。Jenkins 等[12]用全虫抗原与重组Cp41 抗原作对照，检测人血清样本，检测结果一致。由于该抗原制备费时费力，不同批次之间不容易标准化，近年来多用重组表达的抗原代替天然虫体抗原。

1.2.2.2 重组抗原

1.2.2.2.1 CP23 抗原（又称P23、P27 或27 kDa 抗原） 该抗原是隐孢子虫最主要的免疫识别抗原之一。CP23 是一种表面膜蛋白质，最初被报道为一种单独的抗原，后续的实验发现它属于一个分子量相近的蛋白质家族，该家族共包含5 个分子量为23～27 kDa 的蛋白质（包括CP23），这5 个抗原均能被单克隆抗体C6B6 所识别，意味着这5 个蛋白质既拥有共同的蛋白质骨架也有部分结构的改变[13]。Perryman 等[14]也对P23 中的一段多肽进行了序列分析，并推测该蛋白质分子量约为11.2 kDa（GenBank登录号为U34390）。但是，在Western-blot 分析中，该蛋白质的条带出现在23 kDa 位置，因此该蛋白质被命名为CP23，分析原因可能是由于该蛋白的糖基化性质造成了分子量上的差异。

重组CP23 作为诊断抗原得到了广泛应用。Priest 等[13]用重组的CP23 抗原建立的ELISA 与天然抗原检测具有很好的相关性，证实该方法可用于流行病学监测。Borad 等[15]表达纯化CP23 重组蛋白质将其作为抗原，使用ELISA 检测孟加拉国5 岁以下感染隐孢子虫腹泻儿童血清中IgG、IgA 和IgM抗体，以未感染隐孢子虫腹泻组作对照，结果显示试验组血清中3 种抗体水平显著高于对照组，并发现急性腹泻儿童血清中IgA 和IgM 水平显著高于迁延性腹泻病例。该抗原作为诊断抗原的缺点是不能区分是否近期感染，因为即使患者症状恢复后相当一段时间，抗体仍保持高水平。

1.2.2.2.2 CP15/17 抗原 该组抗原为子孢子表膜抗原，大小为15～17 kDa,溶于Triton-X 114。这些抗原与人类感染隐孢子虫产生的IgG、IgA 和IgM 抗体反应，识别15、17、27 kDa 抗原的单克隆抗体，也可以与隐孢子虫的表面抗原发生特异性反应，这些结果说明在隐孢子虫的感染阶段15、17、27 kDa 抗原是重要的抗体靶标[16]。该蛋白质通常与27 kDa 抗原共同用于隐孢子虫病的检测。Chalmers 等[17]用15、17、27 kDa 蛋白质作为抗原，用Western-blot检测人类感染隐孢子虫阳性血清，每60 d 检测1 次。结果显示15/17 kDa 抗原复合物比27 kDa 抗原反应强烈，但是181～240 d 后几乎检测不到抗体反应；27 kDa 抗原反应虽然较弱，但是在感染较长时间后仍能检测到IgG 抗体反应。Priest 等[18]纯化了重组抗原rCp27/GST 与rCp17/GST 重组抗原并偶联微粒子，用MIA 检测了隐孢子虫与贾第虫感染率，结果约40%采集于隐孢子虫暴发流行的血清样品能够被17 kDa 和27 kDa 抗原所识别，至少有60%采集于贾第虫暴发流行的血清样品能够被多种贾第虫抗原所识别。

1.2.2.2.3 CP41 抗原 该抗原位于卵囊壁，2005年Kjos 等[19]扩增CP41 基因，连接pTrcHis 载体后在大肠埃希菌表达了多聚组氨酸融合蛋白质，与制备的微小隐孢子虫全虫抗原同时用ELISA 检测了192名健康成年人血清，结果全虫抗原与重组CP41 抗原检测IgM 抗体一致率为79%，检测IgG 抗体一致率为88%，回归分析表明二者具有很高的相关性，表明CP41 重组蛋白质可代替虫体抗原应用于隐孢子虫感染的检测。

1.2.2.2.4 SA35 与SA40 蛋白 Tosini 等[20]构建了微小隐孢子虫基因组文库，用兔抗微小隐孢子虫血清筛选得到3 个阳性克隆sa20、sa35 和sa40，其中sa35 和sa40 序列定位于第7 号染色体，而sa20 序列定位于第6 号染色体，其中sa40 与GP900 的同源性很高，而GP900 是强免疫原性的蛋白质，推断sa40 与sa35 在宿主体内引起IgG 抗体应答反应。大肠埃希菌表达重组蛋白质，Western-blot 检测结果表明，sa35 和sa40 与兔抗隐孢子虫血清和感染隐孢子虫的人血清有特异性反应。这些结果表明，sa35 和sa40 可能成为诊断隐孢子虫病的检测抗原。这2 种抗原能够被新近感染者的血清所识别。

1.2.2.2.5 CpP2 Priest 等[21]确定了一个大小为15～17 kDa 的新蛋白质——微小隐孢子虫60S 酸性核糖体蛋白P2（CpP2），建立了重组蛋白质CpP2-ELISA检测人血清样本，与Western-blot 相比，其灵敏度为89%，特异度为92%。

2 治 疗

寻求针对隐孢子虫病特别是AIDS 患者隐孢子虫病令人满意的治疗方案，一直是众多研究的目标。过去尝试采用的治疗方案包括：大环内酯类抗生素、氨基糖苷类如巴龙霉素、离子载体类如马杜拉霉素、利福昔明、奥曲肽以及免疫治疗方法[22]。尽管一些药物被证实具有一些疗效，主要是大环内酯类的螺旋霉素和克拉霉素、氨基糖苷类的巴龙霉素、离子载体类药物拉沙里菌素和马杜拉霉素，但研究结果缺乏一致性，治疗效果依赖于机体免疫功能的恢复。在不治疗的情况下，大多数免疫功能正常的患者在2 周内康复。对于免疫缺陷患者，治疗的目的在于减轻症状和免疫系统重建。治疗手段主要包括如下几个方面。

2.1 抗虫化学药物治疗

2.1.1 硝唑尼特 该药已被美国食品药品监督管理局批准用于免疫功能正常的人群，它能够影响隐孢子虫的代谢过程。已证实该药对感染隐孢子虫的儿童腹泻有效。一项来自赞比亚的研究发现，用药前后腹泻程度和粪便中的卵囊数差异明显，但对其他患者延长疗程是否有效有待证实[23]。另一项来自埃及的研究发现，该药能够降低1～11 岁儿童的腹泻程度和卵囊排出量[24]。但对于AIDS 患者来说，该药的疗效不确切。

2.1.2 常山酮内酯 该药可用于犊牛隐孢子虫病的预防，可以减轻症状，并降低对环境的污染。动物实验表明，该药可用于治疗羔羊的隐孢子虫病，能够明显降低卵囊排出量，减轻症状，降低致死率（治疗剂量100 μg/kg）[25]。

2.1.3 阿奇霉素 可作为免疫缺陷患者的辅助治疗药物。

2.2 减少肠蠕动的药物 这一类药物能够通过降低肠蠕动，促进小肠吸收从而减轻腹泻，包括洛哌丁胺及其衍生物。

2.3 电解质补充 通过口服和静脉补充电解质溶液（含钠、钾和钙离子等），可以补充体液的大量流失，保持体液的平衡。

2.4 对AIDS 患者抗病毒治疗的协同作用 对于AIDS 患者，高效抗反转录病毒疗法能够降低体内的病毒载量，激发机体免疫反应。

2.5 蛋白酶抑制剂 半胱氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶已证实参与隐孢子虫卵囊的脱囊过程，与虫体的侵入相关[26]。体外模型和小鼠模型已证实蛋白酶抑制剂可以抑制虫体的侵入和保护小鼠抵抗致死剂量虫体的攻击[27]，有望成为新型的抗虫药物。

3 展 望

目前，对隐孢子虫感染的检测和诊断面临挑战，将不同的诊断方法和不一致的分型技术应用于临床、兽医和环境监测等不同的领域，以及对不同国家和地区间进行检测，其结果不具有可比性。标准化的诊断和分型技术，可以在国家和世界范围内将来自人、动物和环境的数据更好地对接，这将有助于暴发疫情的传染源追溯，更好地研究隐孢子虫的传播与流行。随着功能基因组学、蛋白质组学和代谢组学的迅速发展，相信在不久的将来会有更多、更有效的药物应用于隐孢子虫病的临床治疗。

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