脑囊尾蚴病动物模型研究进展

陈小华，于 璇，郭建勋

脑囊尾蚴病（nuerocysticercosis,NCC）是由猪带绦虫幼虫（囊尾蚴）感染人中枢神经系统（central nervous system,CNS）引起的寄生虫病，是人体囊尾蚴病之一，也是最常见的CNS寄生虫病之一。该病是社区获得性活跃癫疒 间的最常见原因，在包括印度和拉丁美洲在内的发展中国家，26.3%～53.8%活跃的癫疒 间病例是由NCC引起[1]。由于流行区患者迁移活跃和（或）钩绦虫携带者频繁旅游或公务旅行到发达国家，导致近年在北美洲、欧洲和澳大利亚等发达国家再次出现NCC病例[1－2]。囊尾蚴病为我国北方主要的人兽共患寄生虫病，既往在我国东北、华北和西北地区多见，现发现其流行和分布遍及全国各地，且发病数呈不断上升趋势[3]。研究囊尾蚴病的发病机制、病理变化、宿主免疫反应和药物疗效，对人体囊尾蚴病尤其是对NCC的控制显得尤为重要。

早期无症状NCC表现为很少或无炎症状态，而随后发生的有症状NCC则是由囊尾蚴降解导致的强烈炎症反应所致。这些渐进性的过程及其参与机制很难在人体内进行研究，因此有必要建立NCC的动物实验模型[4]。本文就近年来NCC动物模型的建立，以及该模型在宿主免疫反应、血－脑屏障破坏、宿主控制囊尾蚴生长的基因位点、癫疒 间发病机制、诊断抗原以及药物疗效评估等方面的应用研究进行综述。

1 NCC动物模型发展概况

NCC动物模型多集中于啮齿类的小鼠和哺乳动物的猪，兔曾被作为NCC动物模型加以研究，近年来则少有相关报道[5]。肥头绦虫感染的小鼠模型（以下简称NCC小鼠模型1）可以作为一个可控的和相对便宜的动物模型被应用于NCC研究中。构建该模型的理由在于：①由于猪带绦虫成虫携带者病例数较少，且一旦发现即给予治疗，因而难以获得猪带绦虫虫卵，尽管一些动物可能会在实验中感染肠道猪带绦虫，但无一能维持感染到产生孕节和产生虫卵的阶段；②由于在猪体内注射一定数量的虫卵所获得的囊尾蚴数目的不可预知性，作为动物模型的猪，感染猪带绦虫的可重复性极为有限；③处理活的猪带绦虫虫卵对人具有极大的安全风险[6]。Matos-Silva等[7]研究发现，颅内注射肥头绦虫囊尾蚴可导致BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠颅内炎症反应和坏死，前者表现为早期炎症和晚期坏死，以及急性炎症模式；后者则表现为早期坏死和晚期炎症，以及慢性炎症模式。

Cardona等[8]构建了颅内感染的BALB/c小鼠模型，该动物模型由颅内注射中殖孔绦虫而构建（以下简称NCC小鼠模型2）。该研究有助于人们更好地理解发生NCC时机体释放/分泌抗原诱导的免疫反应，以及CNS内环境和发病机制[3]。

2 NCC动物模型的应用

2.1 模型用于囊尾蚴抗原诱导的宿主免疫反应研究 有研究利用NCC小鼠模型2结合基因敲除技术，构建了囊尾蚴颅内感染的多种基因敲除小鼠模型，如 TLR2-/-模型、STAT6-/-模型、MyD88-/-模型以及TCRδ-/-模型等。这些模型所涉及的基因分别参与宿主先天性免疫和适应性免疫反应，用于NCC患者CNS病理生理变化研究。TLR2-/-和STAT6-/-小鼠NCC病情较野生小鼠更为严重，与之相反，MyD88-/-小鼠和TCRδ-/-小鼠病情则较野生小鼠轻[9-12]，这提示多种先天性免疫和适应性免疫分子可能参与NCC宿主免疫反应。

此外，研究者还用实时荧光定量PCR及原位免疫荧光显微镜研究脑部感染囊尾蚴的NCC小鼠模型 2，结果除 Toll样受体（Toll-like receptor,TLR）5在小鼠脑组织蛋白水平表达无上调外，所有其他TLRs（TLR1～4,6～9,11～13）在 mRNA 及蛋白水平均较正常未感染小鼠脑组织表达上调。在感染细胞类型方面，TLR2仅表达于神经细胞，TLR1和TLR9主要表达于渗出的淋巴细胞，其余 TLRs（TLR3～8,TLR11～13）既表达于神经细胞又表达于免疫细胞，这提示TLRs通过免疫细胞和神经细胞的相互作用参与小鼠抗NCC先天性免疫[13]。

2.2 模型用于宿主血脑屏障破坏和白细胞渗出机制研究 大脑内环境的稳定通常受到血-脑屏障（blood brain barrier,BBB）和血-脑脊髓液屏障（blood-cerebrospinal fluid barrier,BCB）的保护，BBB和BCB屏障在CNS不同解剖区域中发挥功能，包括不同类型的血管中，如蛛网膜下腔血管、软脑膜血管、脑实质（大脑皮层）血管和脑室血管。通过对NCC动物模型猪的脑组织免疫组织化学研究，证实NCC猪脑组织内出现星型胶质细胞聚集、轴突降解和BBB渗透性改变[14]。

NCC小鼠模型2被用于鉴别BBB和BCB渗透率变化以及确定这种变化与白细胞浸润的关系。将NCC小鼠模型2在感染后不同时期处死，利用三色免疫荧光抗血清蛋白检测方法，对所感染脑组织的不同解剖区域的BBB通透性、星形胶质细胞表达和特定的细胞表面标志物进行评估，以揭示特定位置的CNS浸润的白细胞亚群情况。结果表明，感染导致脑血管结构及通透性改变、血清蛋白增加和白细胞外渗[15]。其他关于NCC小鼠模型2的研究表明，宿主BBB破坏表现为基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）活性增加和连接复合体蛋白质结构改变及消失；室管膜为白细胞浸润到脑室的主要部位；软脑膜和脑实质的连接复合体蛋白，尤其是紧密连接蛋白和黏附连接蛋白，表现为结构消失或蛋白水解[16-18]。

Mishra和Teale[19]使用激光捕获显微解剖显微结合微阵列分析研究证实，NCC小鼠模型2室管膜细胞382个基因的表达发生了改变，通过实时荧光定量PCR对上述免疫应答相关基因进行了验证。他们用独创性路径分析（ingenuity pathway analysis,IPA）揭示了上述基因参与了先天性免疫反应、抗原表达和白细胞浸润，同时也参与了糖类、脂类以及小分子物质的生物化学反应。此外，他们用荧光显微镜在蛋白质水平证实主要组织相容性复合体Ⅱ类分子和包括趋化因子配体12在内的趋化因子上调。

Mishra和Teale[20]还使用上述研究方法研究证实，NCC小鼠模型2的BBB软脑膜血管受影响的380个基因中，285个基因上调，95个基因下调，进而应用IPA评估具有生物意义的差异表达基因。结果显示，受影响最显著的基因是与炎症反应、细胞间的信号传递和相互作用、细胞运动、免疫细胞运输、抗细菌反应以及胚胎发育相关的基因。该研究提示，NCC小鼠室管膜细胞和软脑膜血管参与免疫介质的表达，并有可能在感染过程中导致所观察到的免疫病理变化。

2.3 模型用于宿主基因对囊尾蚴生长影响的研究 Ramirez-Aquino等[21]使用分子遗传学等手段研究NCC小鼠模型1中影响囊尾蚴生长的宿主基因。结果表明，A/J小鼠对肥头绦虫腹腔感染呈易感状态，而C57BL/6J小鼠则相对不易感，感染30 d后二者腹腔囊尾蚴数量可差10倍；通过2种小鼠的杂交构建了34个不同的AcB/BcA重组同类品系小鼠，通过对单核苷酸多态性的分析，发现影响囊尾蚴生长的宿主基因位于2号染色体和6号染色体上，而更深入的研究发现了在2号染色体上的肥头绦虫限制性位点1，而这个位点的突变导致补体C5的表达缺陷。上述结果提示，补体C5在肥头绦虫感染引起的早期保护性炎症反应中起到了至关重要的作用。

2.4 模型用于NCC癫疒 间发作分子基础研究 NCC是猪带绦虫的囊尾蚴引起人体CNS感染的寄生虫疾病，是癫疒 间 发作的主要原因之一。癫 疒间发作的机制主要是囊尾蚴诱发宿主脑实质炎症反应。既往研究表明在小鼠NCC的早期肉芽肿中辅助性T细胞（T helper cells，Th）1型细胞因子连续表达，随后Th2细胞因子在晚期肉芽肿中表达。小鼠NCC模型1颅内肉芽肿中致炎因子表达与癫 疒间无关[22]。P物质（substance P,SP）诱导Th1细胞因子的表达和肉芽肿形成，而生长抑素抑制肉芽肿反应。有研究表明，神经肽可能调节囊尾蚴病中的肉芽肿反应[21]。为了检验这一假设，他们采用原位杂交和免疫组织化学方法比较了SP和生长抑素在小鼠NCC模型1的囊尾蚴肉芽肿中的表达情况及与肉芽肿的关系。SPmRNA主要表达在肉芽肿形成的早期阶段，而生长抑素mRNA则主要表达在肉芽肿形成的后期阶段。SPmRNA表达在肉芽肿形成早期水平显著高于肉芽肿形成中晚期（P=0.008），生长抑素mRNA在后期肉芽肿阶段的表达水平明显高于早期水平（P=0.008）。SP和生长抑素在时间表达上的差异，可能与小鼠NCC肉芽肿Th1和Th2细胞因子的差异表达相关[23]。

另一研究也通过NCC小鼠模型1诱导癫 疒间发作的研究发现，海马回注射SP或野生型小鼠囊尾蚴肉芽肿提取物可诱发小鼠癫 疒间发 作，而来自SP前体缺陷小鼠或SP受体缺陷小鼠的囊尾蚴肉芽肿提取物则不能诱发癫疒 间发作。癫 疒间发作水平与SP水平正相关，且可被SP受体拮抗剂拮抗。提示SP是诱导人类癫疒 间 的主要物质，且该癫 疒间可能被SP受体拮抗剂预防或治疗[24]。

2.5 模型用于诊断抗原、药物疗效评估和疫苗研究 由于肥头绦虫和猪带绦虫抗原具有高度交叉免疫反应，由肥头绦虫所构建的NCC动物模型可能为人类 NCC 诊断提供基础[25-27]。Espíndola 等[26]利用NCC动物模型构建了肥头绦虫和猪带绦虫囊尾蚴单克隆抗体，发现猪带绦虫18 kDa蛋白与肥头绦虫18 kDa和14 kDa蛋白具有交叉反应性。免疫亲和纯化的18 kDa和14 kDa蛋白被用于ELISA方法诊断NCC，该方法灵敏度达到100%，相对于其他炎症性和非炎症性患者脑脊液，特异度达到99.1%～100%。Peralta等[27]利用NCC动物模型证实由肥头绦虫囊液中纯化的14 kDa蛋白与猪带绦虫抗原具有同源性，有望用于NCC免疫诊断。

为评估地塞米松对NCC诱导炎症反应是否具有保护作用，García de Llano等[28]将囊尾蚴注射入25只兔小脑延髓池，同时使用地塞米松治疗，2周后处死兔，研究其脑部病理变化。发现地塞米松确实对NCC炎症反应具有保护作用。用NCC小鼠模型1研究还证实，多西环素可以通过降低细胞凋亡水平和MMPs活性，从而降低小鼠NCC患病率及病死率[29]。

此外，NCC小鼠模型1和口服猪带绦虫囊尾蚴感染的仓鼠还被用于疫苗研究[30-31]。Baig等[30]使用猪带绦虫半胱甘酸蛋白酶免疫BALB/c小鼠，并以肥头绦虫感染该小鼠，发现免疫后小鼠较未免疫小鼠带虫率下降了72%。León-Cabrera等[31]使用重组的猪带绦虫钙网蛋白免疫仓鼠，发现其对9月龄仓鼠保护率可达到40%～100%。

3 小 结

由猪带绦虫囊尾蚴感染人脑导致的NCC，因其所导致强烈炎症反应、脑水肿、颅内高压及癫疒 间，对人类健康危害极大，但在体内难于开展病理生理机制研究。NCC动物模型多由其他绦虫感染所构建，一定程度上弥补了猪带绦虫囊尾蚴感染动物模型难于构建的不足。

NCC动物模型研究意义在于，无论是有症状的NCC还是无症状NCC，在囊尾蚴感染期间都会诱发先天性免疫和适应性免疫反应的复杂调节状态，伴或不伴有炎症反应。无症状NCC的免疫入侵机制至今未明，NCC小鼠模型为理解NCC不同阶段的潜在机制提供了重要模型。NCC小鼠动物模型揭示，中殖孔绦虫感染在颅内首先诱发Th1免疫反应，巨噬细胞、中性粒细胞和γδT浸润并表达致炎因子，随后αβT浸润。同样应用该模型，成功鉴定了BBB破坏动力学和解剖定位。而且，NCC小鼠模型还研究了包括TLR及其下游信号通路在内的先天免疫细胞受体活性变化，揭示了关于炎症反应的调节机制。NCC小鼠动物模型还在一定程度上揭示了宿主控制囊尾蚴生长的基因位点和癫 疒间发作的分子基础，为诊断抗原、药物疗效评估和疫苗研究提供了良好、可用和可重复性的动物模型。

由NCC实验动物所得研究结果，对理解NCC宿主-寄生虫关系极为重要，如NCC动物模型在宿主免疫、宿主BBB破坏、宿主控制囊尾蚴生长的基因位点、癫疒 间发病机制、诊断抗原和药物疗效评估等方面的研究，一定程度上揭示了NCC病理生理机制，为NCC诊断、治疗及疫苗研究提供了理论依据。

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