固定化微生物对海洋溢油的修复研究

孙会玲，王杏娣，陈庆国，刘 梅，孙静亚，魏榕飞，徐庆达

（1.浙江海洋学院海洋科学与技术学院，浙江舟山 316022；2.浙江国际海运职业技术学院，浙江舟山 316021）

固定化微生物对海洋溢油的修复研究

孙会玲1，王杏娣2，陈庆国1，刘 梅1，孙静亚1，魏榕飞1，徐庆达1

（1.浙江海洋学院海洋科学与技术学院，浙江舟山 316022；2.浙江国际海运职业技术学院，浙江舟山 316021）

溢油对海洋生态环境和海洋资源都有长期的危害，溢油污染已经成为人们必须面对的重大环境问题。微生物修复技术可以处理物理方法和化学方法无法清除的残余溢油是恢复生态环境的最佳途径。固定化技术与微生物结合，能够保持微生物高密度、高活性，增强其环境耐受性，提高其降解石油烃的效率，得到了研究者的重视。本文介绍了固定化材料和方法，降解石油烃的微生物的种群，综述了固定化细菌、真菌、微藻在海水、滩涂溢油修复中的研究进展，菌藻组合的优势及在石油烃降解修复中的应用，并对其发展方向进行了展望。

溢油；微生物；固定化；生物修复

原油及衍生品在全球的使用和分布对海洋环境造成了极大的潜在危害[1]。海上油田的井喷、油船的泄露等都会对海洋造成严重且持久的污染。微生物修复技术[2]，采用该技术可以处理物理和化学方法无法清除的溢油，而且其成本低、环境友好且不产生二次污染，被认为是恢复生态环境的最佳途径[3-5]。

固定化微生物具有细胞浓度高、反应速度快、微生物流失少、产物易分离等优点[6]，且固定化微生物对pH值、盐度的适应性更强、对环境的耐受性也有所增强、对石油烃的降解率要高[7]。因此，用固定化微生物对海洋溢油的修复越来越受到研究者的亲睐。

本文介绍了固定化材料和方法，降解石油烃的微生物的种群，综述了固定化细菌、真菌、微藻在海水、滩涂溢油修复中的研究进展，菌藻组合的优势及在石油烃降解修复中的应用，并对其发展方向进行了展望。

1 微生物的固定化材料与方法

1.1 微生物的固定化材料

固定化载体的作用不仅是将微生物固定，以防微生物被冲淡；而且其表面可以促进生物膜的自然形成[8]。此外，固定化载体还应该廉价易得，对环境不产生污染。

固定化载体主要包括无机载体、有机高分子载体和由此两者组成的复合载体，其中有机高分子包括天然有机高分子和合成有机高分子[9]。BAI等[10]用碳酸钙和PVA制成了一种新的固定微生物的复合载体。

随着对载体研究的深入，研究者把目光转向了不仅吸附性好、且价格低廉、来源丰富的天然材料[11-14]，如贻贝壳、贝壳砂等。

1.2 微生物的固定化方法

微生物的固定化方法有包埋法[15-18]、吸附法[19]、交联法[10]以及共价结合法，大多数固定化采用包埋法。

用包埋法将细菌固定在载体上，固定后其形状多为微球，且张秀霞[20]等研究表明球形载体比片形载体的固定化菌降解效率要高，这可能是因为球形与原油的接触面积大，有利于细菌降解石油烃。包木太等[15]用包埋法将细菌固定在海藻酸钠-氯化钙载体中，活性炭的添加增强了载体的传质性和机械强度，使得固定化菌可以更好吸收外界进行营养物质和溶解氧。固定化菌对原油的降解率比游离态菌提高了20%。

2 石油烃降解微生物研究

能够降解海洋石油污染物的微生物有细菌、真菌、微藻等200多种，分属于70个属，其中细菌种群最为众多，有约40个属[3]。表1中列出了部分利用微生物处理石油烃的研究进展。

利用细菌降解油污的研究开始于20世纪40年代[4]，起步较早，因而对细菌降解机理研究[31-33]较多较深入。细菌将石油烃作为碳源和能源，对烃类化合物代谢的关键步骤是底物被氧化酶氧化的过程，此过程需要分子氧参与[34]。当海上发生溢油时，石油烃降解菌会大量繁殖，此时碳源充足，但氧和营养盐供应不足会限制石油烃的降解。所以为促进细菌降解石油烃往往会向被污染的海域投入氮磷营养盐[35]。

轻油和中油会在海水表面迅速的扩散，形成厚度为100 μm或者更薄的油膜[36]，使其处理困难。而真菌的菌丝会将石油聚集成团[37]，通过物理收集即可除去石油和菌丝，达到去除油膜的目的。林凤翱等[28]从海洋中分离出了4株降解石油烃丝状真菌，2株青霉菌，另外2株分别为曲霉菌和镰刀菌。将这4株石油烃降解真菌与石油烃降解菌比较，真菌降解石油烃的速率为2.00×10-9～1.70×10-7mg/(cell·h)，是石油烃降解菌降解速率数百倍或数万倍。而且这4株真菌降解石油烃时不需要添加氮磷等营养盐。ZINJARDE等[38]从孟买港被原油污染的海水和沉积物分离出11种细菌和6种酵母菌。在温度为30℃、原油含量为0.5%时，6种酵母菌中的Yarrowia lipolytica对脂肪烃含量较高的原油降解率最高可达80%。然而，将固定的真菌来处理海洋溢油的研究还未见报道。

表1 降解石油烃微生物的研究进展Tab.1 Research progress of microorganism degradating petroleum hydrocarbons

自1953年，一些微藻被发现能利用有机物作为唯一碳源和能源进行异养生长，培养异养微藻的研究就此拉开序幕[39]。微藻可以异养降解石油烃是微藻能在溢油污染的情况下生长的原因[40]。梁译之[30]等以微藻内脂肪含量为指标研究海水小球藻和盐生杜氏藻对带共轭双键的烃类化合物和芳烃的降解效果。当石油浓度为3.5 μg/mL时，这两种微藻对带共轭双键的烃类化合物和芳烃的降解效果最好。

固定化技术与微生物结合，在克服微生物流失快等缺点的同时，还可以提高其对环境的耐受性，使其可应用范围扩大。

3 固定化细菌在海洋溢油中的应用

当海上发生溢油事故时，大部分油品可以通过物理方法回收，剩下的部分依然暴露在海洋环境中，海底沉积物是其最终的汇[41]。HII等[42]研究了石油烃降解菌群对海底沉积物中石油烃的分解情况。当溢油发生在港口时，岸滩也会被石油烃污染。本部分从海水和岸滩二方面综述了固定化细菌在海洋溢油中的应用。

3.1 固定化细菌在处理海水中石油烃的应用

QUEK等[33]用聚氨酯泡沫固定石油烃降解菌Rhodococcus sp.F92降解石油烃，聚氨酯泡沫对该菌的吸附率可达109个/cm。温度为30℃，7 d后显示无论是游离态的还是固定态的F92对总烷烃的降解率都将近90%。

GENTILI等[43]用从虾的废弃物中提取了甲壳素和壳聚糖为载体固定石油烃降解菌Rhodococcus corynebacterioides。15 d后，试验结果显示，以甲壳素为固定化载体的对石油烃的效果最好，石油烃降解率为60%。

李馨子等[44]用海藻酸钠包埋海洋石油烃降解菌Alcanivorax sp.97CO-5降解石油烃，并在14 d后对实验结果进行了测定。结果表明，固定化菌剂对石油的降解率为34.1%。对石油中总烷烃降解率为57.9%，对石油中的芴和二苯并噻吩两类烷基化多环芳烃的降解率分别达到了44.9%和44.2%。

3.2 固定化细菌在岸滩溢油污染处理中的应用

TSUTSUMI等[45]用泰然酶（TerraZyme）固定石油烃降解菌在纳霍德卡岸进行了现场试验。试验开始前，实验组区域石油覆盖率为91.0%±6.6%，对照组为87.0%±8.2%。八周后，实验组区域石油覆盖率降低到13.7%±8.2%，对照组为51.0%±16.1%，可见，实验组区域比对照组区域的石油覆盖率明显降低。

郑立等[46]基于石油烃降解菌群DC10研制成降解菌剂应用于在大连溢油污染岸滩进行修复研究。结果表明，12 d的潮间带修复试验中，实验组相对于对照组总烷烃和总芳香烃降解率分别提高了80%和72%。86 d潮上带修复试验中，实验组对总烷烃和总芳香烃比对照组分别提高30%和20%。

4 固定化菌藻在石油烃降解中的应用

微藻中有几种可以降解烃类[47]，然而，目前仅少量报道研究固定微藻降解石油烃[40]。SUZUKI等[40]将Prototheca zopfii固定在海藻酸钙微粒上，比较了固定藻和游离藻以及固定藻和一些已知的石油烃降解细菌。实验结果显示，固定藻和游离藻都可以很好的降解石油烃，虽然固定藻的第一个降解周期要长于游离藻，但是固定藻降解石油烃重现性要比游离藻高；且固定藻的石油烃降解率高于实验对照的石油烃降解菌。

唐霞[48]研究了藻-菌体系降解原油性能，发现从石油污染水体中分离得到的天然颤藻-附生菌体系和人工构建的纯斜生栅藻-石油组分降解菌体系对初始浓度为3%的原油的主要成分有高效的去除作用。但菌藻之间的相互作用机制仍不明确。MCGENITY等[49]认为微生物降解石油并不是某种特定的微生物在起作用，而是细菌、真菌和微藻之间的共同作用。微藻的藻际微环境中有着大量的异养型的细菌，微藻和细菌间必然存在着互利关系，微藻为细菌提供碳源和能源，细菌提供铁、红血素、维生素B12，并消耗氧气以保护微藻对抗活性氧簇。微藻和细菌之间的关系对石油烃的降解有着非常重要的作用。许多藻类都可以产生可挥发性的烃类，使得石油烃降解菌群在没有溢油的时候得以维持。这就解释了通常在微藻或者大型藻发现食烷菌的原因。而烃类的存在也许加强了微藻和细菌之间的关系。例如，微藻释放的氧气对于活化烃类非常重要，且氧气可以作为有氧呼吸的电子接收体。另一方面，异养细菌使得微藻周围局部的二氧化碳浓度增高，进一步加强了光合作用。微藻产生的有机化合物也可能在不同程度上影响烃类的降解。

周瑜[36]等比较了单独培养时的菌株和用微藻共培养菌株的降解率，结果发现，与微藻共培养后，部分菌株的降解率有所提升。此研究为菌藻降解石油烃提供了又一支持。目前，固定化菌藻大多用于处理废水中的氮磷[50-52]。好氧细菌在氧的充足条件下可更好的降解石油烃[4]，微藻光合作用产生的氧气比人工充氧更能被细菌有效利用[53]。菌藻组合，并使之固定化，在处理海洋溢油中会具有极大的应用潜力。

5 展望

基于固定化微生物的在海洋溢油修复的优势，可以从以下方面继续开展研究：

（1）微生物中关于真菌降解海洋中石油烃的研究较少，筛选分离更多石油烃降解真菌将其固定化后用于海洋溢油的处理成为一个研究开展方向。

（2）寻找更多的可降解石油烃的微藻，进一步研究微藻降解石油烃的机理。重点研究异养微藻降解石油烃，这样微藻不仅处理了溢油污染，还可以制备生物柴油。

（3）开展固定化藻菌在处理海洋溢油方面的研究。结合微藻和细菌在降解石油烃的优势，固定化藻菌在处理海洋溢油中会有巨大的潜力。

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Study on Application of Immobilized Microorganism in Marine Oil Spill Bioremediation

SUN Hui-ling1,WANG Xing-di2,CHEN Qing-guo1,et al
(1.Marine Science&Technology School of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022; 2.Zhejiang International Maritime College,Zhoushan 316021,China)

Marine oil spill can hazard marine ecological environment and resource for a long times,and it becomes a serious environmental problem.Microorganism remediation is the best way to deal with the residual oil which is failed to be cleaned up by the physical and chemical methods.Combining immobilized technology and microorganism attracted many researchers’eyes,for its advantage of high density and high activity of microorganism,and more tolerance to environment,which could improve the efficiency of petroleum hydrocarbons degradation.In this paper,materials and methods of immobilized technology and species of microorganism degrading petroleum hydrocarbons were introduced,the progress of the utilization of immobilized bacteria,fungus and micro-algae in remediation of seawater and shore oil spill was reviewed and the advantages of immobilized algae-bacteria and its application in remediation of marine oil spill were summarized.Finally,an outlook on the development of microorganism immobilized in remediation of marine oil spill was introduced.

oil spill;microorganism;immobilized;bioremediation

X55

A

1008－830X(2015)06－0565－06

2014-07-30

浙江省自然科学基金（LQ13D060001；LY14D060003）；浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划项目（2013R411042）

孙会玲（1989-），女，河北承德人，硕士研究生，研究方向：海洋溢油生物修复.E-mail:226545932@qq.com

陈庆国（1984-），男，博士，讲师，研究方向：海洋生态污染修复.E-mail:qgchen@zjou.edu.cn