人肺鳞癌细胞电阻抗谱测量实验研究

张 倩 方 云 董长征 马 青

(宁波大学医学院，浙江 宁波 315211)



人肺鳞癌细胞电阻抗谱测量实验研究

张 倩 方 云 董长征 马 青*

(宁波大学医学院，浙江 宁波 315211)

在1 kHz～100 MHz范围内，采用Agilent 4294A精密阻抗分析仪，测量人肺鳞癌SK-MES-1细胞悬浮液的电阻抗，通过电阻抗频谱图和Nyquist图的分析，提取肺癌细胞电阻抗频谱的特征参数，并与人正常肺上皮BEAS-2B细胞进行比较。结果显示：肺癌细胞与正常人肺细胞悬浮液的电阻抗谱存在着较显著的差异；肺鳞癌细胞的电阻抗实部增量最大值(ΔZmax)和电阻抗虚部峰值(Z″P)与细胞体积分数(Φ)呈线性关系；肺鳞癌细胞悬浮液阻抗谱的特征频率(fc)低于正常人肺细胞的54.72%(P<0.001)，并且不受细胞体积分数的影响。这表明，细胞悬浮液阻抗谱特征频率可以用于区分肺鳞癌细胞和正常人肺细胞，可为肺鳞癌细胞的鉴定与分型提供电生理指标。

人肺鳞癌细胞；电阻抗频谱；Nyquist图；特征频率

引言

肺癌的发病率和死亡率在中国乃至全世界皆位居首位[1]。肺癌的种类和分期较复杂，因此需要不断发展新的诊断方法来完善肺癌的早期诊断技术。细胞在癌变过程中，除了结构和功能发生变化外，其电生理特性也会发生明显变化[2]。电阻抗技术是一种非侵入性、免标记、实时性强[3]的电生理研究方法，最早应用于细胞生物学和食品检测领域，如细胞培养实时监测[4-5]和细菌检测[6-7]等。目前，电阻抗技术已经应用于人体离体及在体组织水平和细胞水平的理论研究及临床应用，比如基于人肺组织电阻抗谱的肺癌诊断，基于细胞悬浮液阻抗谱的乳腺癌细胞分期[8]，脂肪干细胞[9]、卵巢癌细胞[10]、神经细胞[11]的电阻抗特性研究等。但是，人体组织的复杂结构以及不匀质性，使得在组织学水平上的电阻抗研究较为复杂，而且不能直观反映细胞水平的电阻抗信息。因此，笔者在1 kHz～100 MHz范围内，应用阻抗测量技术，研究肺鳞癌细胞SK-MES-1和人正常肺上皮细胞BEAS-2B悬浮液的电阻抗频谱特性，分析了两者之间的差异，探讨利用细胞学水平上的电阻抗差异来辅助诊断肺癌的可行性。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人正常肺上皮细胞BEAS-2B和人肺鳞癌细胞SK-MES-1(中国科学院上海生命科学研究院细胞库)分别使用RPMI-1640(GIBCO公司)和MEM(GIBCO公司)的培养基培养。培养基含有10%小牛血清(Hyclone公司)、100 U/mL青霉素和链霉素(GIBCO公司)，细胞培养环境设置为温度37℃、CO2浓度5%、湿度100%。

1.2 细胞悬浮液的准备

在无菌条件下，将贴壁生长的BEAS-2B和SK-MES-1细胞，消化收集到15 mL离心管中。将离心管在25℃、1 000 r/min的条件下离心10 min，得到高浓度富集细胞悬液，待电阻抗测量。

1.3 电阻抗谱与细胞体积分数的测量

电阻抗谱与细胞体积分数测量见参考文献[12]。

图1 不同体积分数时细胞的电阻抗谱。 (a)和(b) 人正常肺上皮BEAS-2B细胞和肺鳞癌细胞的Z(f)曲线；(c)和(d) 人正常肺上皮BEAS-2B细胞和肺鳞癌细胞的Z″(f)曲线Fig.1 The electric impedance spectra of BEAS-2B and SK-MES-1 cell suspensions of different volume fractions. (a) and (b)The real parts Z(f) of BEAS-2B and SK-MES-1; (c) and (d) The imaginary parts Z″(f) of the two cells

1.4 电阻抗关系式

测量完毕后，需要将测量到的电容C和电导G转换成复电阻抗，复电阻抗Z*=|Z*|×e-jθ=Z′+jZ″。其中，实部Z′=|Z*|cosθ，虚部Z″=|Z*|sinθ，相位角θ，电阻抗实部增量ΔZ=Z-Zh，Zh为电阻抗实部高频极限值，实部增量最大值ΔZmax=ZL-Zh，其中ZL为电阻抗实部低频极限值。电场频率f，电阻抗谱特征频率记为fc，角频率ω=2πf，虚部单位j=(-1)1/2，电阻抗虚部峰值记作Z″P。

2 结果

2.1 细胞电阻抗频谱

图1中的(a)和(b)分别为正常肺上皮BEAS-2B细胞和肺鳞癌SK-MES-1细胞的电阻抗实部Z随外加电场频率f变化的曲线。两者有相似之处：一是在1～100 kHz范围内，电阻抗实部曲线基本保持水平，下降趋势不明显；在100 kHz～100 MHz范围内，Z值随着频率的增加显著下降。二是随着细胞体积分数的增加，Z值也随之增加，在1～100 kHz范围内增加的幅度较大，在100 kHz～100 MHz范围内增加的幅度较小。三是电阻抗实部最大增量ΔZmax与细胞体积分数Φ呈线性关系，其线性回归方程分别为：正常肺上皮细胞ΔZmax=12.78+4.08Φ，肺鳞癌细胞ΔZmax=-10.59+4.37Φ。肺鳞癌细胞的斜率高于正常肺上皮细胞，表明细胞悬浮液体积分数的变化对肺癌细胞电阻率的影响大于对正常细胞电阻抗的影响。由于不同细胞体积分数的电阻抗实部高频极限值接近，所以电阻抗实部最大增量ΔZmax实际上由电阻抗实部低频极限值决定，反映了细胞悬浮液阻抗谱在低频时的阻抗特性。

图1(c)和(d)分别为正常细胞与肺鳞癌细胞的电阻抗虚部Z″随外加电场频率f变化的曲线。它们的相似之处：一是随着外加电场频率的增加，曲线呈单一弛豫峰分布。二是电阻抗虚部峰值Z″P与细胞体积分数Φ呈线性关系，其线性回归方程分别是：正常肺上皮细胞Z″P=8.09-1.01Φ，肺鳞癌细胞Z″P=11.90-1.12Φ，肺鳞癌细胞对应的Z″P与Φ之间的线性回归方程的截距和斜率不同于正常肺上皮细胞。三是电阻抗虚部峰值对应的电场频率为细胞悬浮液阻抗谱的特征频率fc，其中BEAS-2B的特征频率处于0.7 MHz附近，而SK-MES-1的特征频率明显降低，处在0.3 MHz附近。另外，随着细胞体积分数的增加，细胞的特征频率基本保持不变。

2.2 细胞的Nyquist图

图2中(a)和(b)分别为BEAS-2B和SK-MES-1细胞的Nyquist图，又称复电阻抗平面图，描述了不同频率的电阻抗实部Z与虚部Z″之间的关系。随着外加电场频率的增加，Nyquist图从右向左延伸为半圆弧和一个上扬尾，圆弧的圆心在横轴的下方，圆弧顶点对应特征频率fc处的复电阻抗，横轴的右截距为ΔZmax。随着细胞体积分数的增加，Nyquist图向右扩展，圆弧包围面积增加，实部增量最大值ΔZmax增加。与正常肺上皮细胞比较，鳞癌细胞的ΔZmax略低。

从图1和图2提取的相关电阻抗参数见表1。细胞悬浮液阻抗谱受细胞种类和悬浮液体积分数的影响。通过对不同体积分数条件下阻抗参数值的提取，分析其参数数值与体积分数的关系，有助于确定该参数是否可以作为细胞的特征参数。特征参数可以用来简化图形形式的阻抗谱，同时可用于细胞分型及细胞的定量计算。

图2 不同体积分数时细胞的Nyquist图。(a)BEAS-2B；(b)SK-MES-1Fig.2 The Nyquist plots of BEAS-2B and SK-MES-1 cell suspensions of different volume fractions. (a)BEAS-2B;(b)SK-MES-1

表1 正常细胞与肺鳞癌细胞的电阻抗频谱特征参数

Tab. 1 The electrical impedance spectral characteristic parameters of human lung squamous carcinoma cells and normal cells

细胞体积分数/%实部最大增量ΔZmax/(Ω·cm)虚部峰值Z″P特征频率fc/MHzBEAS⁃2BSK⁃MES⁃1BEAS⁃2BSK⁃MES⁃1BEAS⁃2BSK⁃MES⁃11576327335970903066031251066410630156916580660293516124131032966237306603144182781836538693867071029

2.3 细胞特征频率与体积分数的关系

图3是细胞特征频率fc与体积分数Φ之间的散点图。在Φ=14%～52%范围，经过线性回归分析，得到fc与Φ的线性回归方程(见图3)。结果表明，两条线性回归方程的斜率(-0.000 6和-0.000 2)极低，即回归直线近乎与横坐标轴平行，这说明特征频率与细胞体积分数的变化无关。最重要的差别是：肺癌细胞悬浮液阻抗谱的特征频率fc显著低于正常细胞的这一数值，只有正常人肺细胞悬浮液阻抗谱特征频率的54.72%(P<0.001，如图4所示)。

图3 特征频率与细胞体积分数的关系Fig.3 Relationship between characteristic frequency and cell volume fraction

图4 细胞特征频率的比较Fig.4 Comparison of cellular characteristic frequency

3 讨论

细胞悬浮液属于非均匀的电介质体系，具有绝缘和导电双重特性。细胞膜将细胞内液和细胞外液隔离，形成细胞内液-细胞膜-细胞外液三相的结构，细胞膜内外介质的电导率不同。当细胞处于频率变化的电场中时，在细胞膜两侧会形成离子聚集，从而产生细胞界面极化现象，即Maxwell-Wagner效应[13]。此效应可以依据激励电压V(ω)与响应电流I(ω)之比等于复数电阻抗(Z(ω)=V(ω)/ I(ω))，实现细胞电阻抗频谱测量。

由图1可知，人肺癌细胞悬浮液的电阻抗谱表现为：在1 kHz～100 MHz频率范围内，随着外加电场频率的增加，细胞的电阻抗实部(Z)先保持稳定然后逐渐减小，电阻抗虚部(Z″)呈现先增后减的单峰状。该现象可以依据细胞三元件电路模型[14]进行解释：当外加电场角频率(ω=2πf)较低时，细胞膜的容抗(Zm=1/jωC)较大，电流将会绕过细胞在细胞外液中流动，此时细胞膜相当于电容性断路状态，表现为高阻抗性。 随着电场角频率(ω=2πf)的增加，细胞膜的容抗(Zm=1/jωC)逐渐减小，少量电流可以通过细胞膜。当外加电场频率足够高时，细胞膜容抗相当低，此时电流可以顺利通过细胞内液，细胞膜处于电容性短路状态，表现为低阻抗值。在图1(c)和(d)中，因存在外加交变电场诱导的细胞膜极化作用，当外加电场频率等于fc时，电阻抗虚部(Z″)达到峰值(Z″P)。另外，肺癌细胞悬浮液的电阻抗谱受悬浮液的体积分数影响，即随着细胞体积分数的增加，细胞的电阻抗的实部(Z)和虚部(Z″)及实部最大增量(ΔZmax)都随之增加，但阻抗谱的形状基本保持一致。该现象的解释是：当细胞体积分数增大时，细胞密度增加，单位体积极化的细胞膜表面积也随之增大，引起电阻抗实部Z、虚部Z″和实部最大增量ΔZmax增大。结合表1可知，肺癌细胞的ΔZmax和Z″P均低于正常细胞，原因是：与正常细胞相比，癌细胞的细胞膜渗透性较高[15]，细胞骨架较为松散不规则，骨架蛋白成分也发生改变[16]，这些细胞结构和组成上的变化导致癌细胞的电阻抗低于正常细胞。

图2所示复阻抗平面图的半圆弧特征来源于细胞膜的极化效应，即Maxwell-Wagner效应，也是肺癌细胞电阻抗在复平面的特征性响应。图3的特征频率fc与体积分数的回归曲线分析表明，测试样本的fc与体积分数不相关。体积分数表明测试样本中所含细胞的多少，图4显示肺癌细胞的fc显著低于正常细胞，说明了fc的重要意义。fc的变化反映了正常人肺上皮BEAS-2B细胞与肺鳞癌SK-MES-1细胞自身内在的固有特性，与测试样本中所含细胞的多少无关。在本研究中，肺癌细胞的fc显著低于正常细胞的结果，为肺癌细胞的鉴定或分型提供了重要的实验依据，可作为肺癌细胞鉴定与分型的电生理指标。

4 结论

通过细胞电阻抗谱的测量，获得肺鳞癌细胞(SK-MES-1)频域电学特性，如电阻抗实部最大增量(ΔZmax)、虚部峰值(Z″P)和特征频率(fc)等特征参数，并发现肺癌细胞的ΔZmax、Z″P和fc低于正常肺上皮细胞,故可应用这些电特性指标观察或评价抗癌药物的疗效。

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The Measurement of Electrical Impedance Spectrum of Human Lung Squamous Carcinoma Cells

Zhang Qian Fang Yun Dong Changzheng Ma Qing*

(MedicineSchool,NingboUniversity,Ningbo315211,Zhejiang,China)

human lung squamous carcinoma cell; impedance spectra; Nyquist plots; characteristic frequency

10.3969/j.issn.0258-8021. 2015. 01.016

2014-09-09， 录用日期:2014-10-23

浙江省新苗人才计划(2013R405060)；宁波市自然科学基金(2012A610211，2013A610211)

R734.2 Q64

D

0258-8021(2015) 01-0114-05

*通信作者 (Corresponding author)， E-mail: maqing@nbu.edu.cn