体外肝细胞培养及在药物筛选中的应用

罗南书 罗南英

1(吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南吉首 416000)

2(重庆市九龙坡区第三人民医院，重庆 400080)

引言

肝脏是人体内最复杂的器官之一，负责执行多种功能，解毒是其中非常重要的一种功能。外源性药物经过肝脏代谢后，多数药物对人体的毒性被消除，但也有部分无毒或低毒的物质经过生物转化后成为有毒或毒性更高的物质。作为这个生物转化过程的发生器官，肝脏必然成为研究药物毒性的重要靶器官。利用传统的动物体内实验进行药物毒性研究，耗费大量人力财力，且实验周期长，种属差异大。而体外培养细胞周期短，操作方便，并能避免应用动物模型所出现的种属、个体差异及体内各种复杂因素的干扰，更适于高通量药物筛选。近年来，体外培养肝细胞已开始用于药物筛选［1－2］。

随着对肝细胞生物学和细胞－基质相互作用理解的增强，肝细胞体外培养模型经历了从传统的二维(2D)模式如单层贴壁细胞培养向更先进的生物模拟的三维(3D)模式的转变［3］(见图1)。文中就体外肝细胞培养模型及其在药物筛选中的应用作简要综述。

1 种子细胞来源

体外肝细胞培养所用的细胞主要有原代肝细胞、永生化肝细胞和干细胞。由于原代肝细胞具有肝脏的所有特异性功能，能更好地模拟体内肝脏的生理环境，可用于酶诱导和抑制研究、药物中通量筛选，是检测种间和个体间代谢差异的理想模型［8］。但原代肝细胞在每次实验之前均需通过复杂的步骤从肝组织中分离出来［9］，对培养条件要求较为苛刻，且细胞活力、形态、结构、基因表达及肝功能随时间而发生改变，最终去分化而丧失肝功能［10］，故而限制了其在体外培养中的应用。常用的永生化肝细胞有 Fa2N-4、HepG2、Hep3B、Plc/PRFs、Huh7、HBG 和 HepaRG［11－12］。虽然永生化肝细胞系比原代细胞操作简单方便，可无限增殖，且表现出不同程度的肝特异性功能，但它们都不能表现肝脏执行的全部功能，并带有致瘤的风险［13］，因而其应用也有限。目前干细胞被认为是肝细胞的一种更可靠和丰富的来源。胚胎干细胞由于涉及道德伦理问题而不能大规模获得和应用，而由Takahashi等引入的诱导多能干细胞(iPS)则因无道德伦理限制而具有广阔的应用前景［14］。但由干细胞分化为肝细胞的条件还需进一步优化，以缩短分化时间，获得功能稳定的肝细胞。

2 二维培养模式

图1 体外肝细胞培养的不同方法。(a)三维多孔支架［4］;(b)肝细胞球状聚集体的形成［5］;(c)肝细胞和成纤维细胞的微图式化共培养［6］;(d)用于肝组织移植的脱细胞基质;(e)3D多孔微流控生物反应器［7］;(f)无支架细胞片层技术Fig.1 Different methods for hepatocyte culture in vitro.(a)3D porous scaffolds［4］;(b)Spheroid formation for hepatocyte culture［5］; (c)Micropatterned co-culture of hepatocytes and fibroblasts［6］;(d)Decellularized matrices for liver tissuegrafts;(e)3D multiwellmicrofluidic perfusion bioreactor［7］;(f)Cell sheet technology to obtain scaffold-free multilayers

体外肝细胞培养的最简单方法是悬浮培养或单层培养。悬浮培养细胞缺乏细胞－基质接触，而静态单层培养细胞则生长于弹性膜或用ECM蛋白包被的平面上，I型胶原是常用的包被物。在微量ECM组分包被基底或作为培养基营养成分的条件下，细胞的功能会增强，而表型无变化［15］。将肝细胞在基质胶上进行单层培养时，在48 h内可形成球状聚集体并能维持其大部分肝脏特有功能，但随时间增加某些功能丧失［16］。在肝生物基质(从整个肝脏制备的ECM纯化提取物)上培养的肝细胞与用基质胶培养的肝细胞同样可增强其肝特异性功能［17］。Flaim等对ECM的32种蛋白成分进行了高通量微图式组合筛选，发现I型和IV型胶原蛋白与纤连蛋白和层粘连蛋白结合对肝细胞白蛋白的分泌有促进作用［18］。另外，I型胶原和纤连蛋白的共存可促进细胞分化为肝细胞系。然而这些方法均有一个主要缺陷，即肝细胞在二维体外培养平台上培养时，短期内(小于72 h)即丧失其活力和功能，氧化作用差，因而不能用于长期的药物毒性研究。

为了在肝细胞两侧提供类似肝脏中的ECM环境，Nahmias等建立了一种培养肝细胞的夹层结构，结构中ECM蛋白的叠加为肝细胞提供了黏着斑定位的黏附配体并维持其类似体内的细胞极性(见图2)［19］。Dunn等观察到肝细胞的夹层培养可维持肝细胞较长时期(大于6周)的肝特异性功能如白蛋白、尿素和胆汁酸的分泌，而单层培养仅能维持1－2周［20］。现已证明覆于细胞上层的硫酸肝素蛋白聚糖可促进细胞间隙连接的形成和基底表面标志物的表达，但覆盖层的具体成分对肝细胞功能没有任何促进作用。夹层结构培养阻止了肝细胞仅附着于单层一侧而导致的应力纤维形成，但培养一段时间后，肝细胞会发生I期或II期解毒过程的不平衡及旁分泌信号或其他信号分子扩散的紊乱［21］。田青华等制备了不同尺寸的微柱阵列结构用以培养单层肝细胞，发现阵列结构促进肝细胞功能，但仅研究了短期效应［22］。

3 三维培养模型

3.1 球状聚集体培养

培养肝细胞球状聚集体主要有两种方法，一是将肝细胞在聚合物包被的表面上培养，通过肝细胞与基质的相互作用使球状聚集体自发形成。这类包被物包括天然ECM成分、蛋白聚糖、胶原蛋白连接的热反应聚合物、带负电荷的聚合物如丙烯酸树脂、半乳糖支架和聚乳酸(PLLA)等。二是利用物理手段来增加细胞－细胞之间的相互作用以诱导细胞聚集，常用的方法有悬液滴法、旋转培养或搅拌、振荡、施加外力如使用超声等，其中振荡培养比旋转培养具有更快和更高的肝细胞球状聚集体形成率［23］。

图2 肝细胞形态和肌动蛋白纤维的分布［19］。(a)单一胶原凝胶培养;(b)胶原夹层培养Fig.2 Morphology and localization of actin fibers in hepatocyte cultures on a single collagen gel(a)and in a collagen sandwich(b)［19］

尽管培养的球状聚集体可以维持良好的细胞活力和肝细胞表型，但由于球状聚集体形成的滞后期(从几小时到几天)以及球体尺寸的难以控制，大规模地应用球状聚集体仍不可行。小尺寸的球状聚集体由于细胞之间的相互作用较弱而不一定能提供所需组织水平的生理特性，而太大的球状聚集体则由于胆汁积聚和缺乏足够的氧气易在球体中心形成缺氧或坏死的细胞。有研究表明尺寸为100 μm的球状聚集体具有较高的白蛋白分泌率，而尺寸为200 μm的球状聚集体受营养限制而有坏死的核心区域［24］。目前已有多种方法应用于诱导具有控制尺寸球状聚集体的快速形成，如控制支架的拓扑结构、结合细胞粘附配体以维持球状聚集体与基质的黏附、微流控装置(MD)以及微图式等［25－26］。

由多种类型细胞如实质细胞、非实质细胞(NPC)或与成纤维细胞共培养形成的球状聚集体［27］，其细胞功能或存活力增强，已被用于检测细胞－细胞之间的相互作用。在大鼠肝细胞与星状细胞的三维共培养中，100～150 μm的球状聚集体形成了肝超微结构如胆管、桥粒和紧密连接，增强了CYP3A和CYP2B的活性以及 ECM的合成［28］。Kostadinova等在24孔板内利用可拆卸小室共培养肝脏所有类型细胞，可维持肝脏功能长达3个月，并可用于药物毒性检测［29］。然而，由于不同细胞类型的粘附性差异而难以控制异质球状聚集体的形成。为了解决这个问题，Kojima等在不同类型细胞表面引入抗生物素蛋白或生物素，利用抗生物素蛋白－生物素结合的机制，使细胞自组织形成异质球状聚集体(见图 3)［30］。

图3 不同类型细胞通过抗生物素蛋白-生物素结合机制形成异质球状聚集体示意图［30］。(a)一分子抗生物素蛋白结合四分子生物素;(b)抗生物素蛋白标记的MS1细胞轻易与生物素标记的HepG2细胞结合形成聚集体Fig.3 Schematic model of AB-dependent aggregation using different type cells［30］.(a)An avidin molecule can bind to four biotin molecules;(b)An Avi-MS1 cell easily binds to Bio-HepG2 cells

3.2 细胞片层技术

一种刺激响应性聚合物包被的表面已被用于获得不含任何人造支架材料的细胞片层［31］。该方法是将细胞在结合了一种温度响应性聚合物如聚N－异丙基丙烯酰胺凝胶的表面上培养。聚N－异丙基丙烯酰胺凝胶具有较低的溶解温度(32℃)，高于此温度时该聚合物是疏水性的且不溶于水。37℃时细胞在此疏水性表面易于黏附，而在20℃ ～25℃时由于结合的聚合物构象改变而发生分离。由于无需酶处理而发生细胞剥离，细胞片层技术(CST)为保持细胞－细胞之间的相互作用提供了有效的方法。利用这种方法可获得二维和三维的肝细胞片层以及由肝细胞和非实质细胞共同构成的细胞片层［32］(见图4)。影响细胞的剥离或黏附的因素有连接聚合物链的密度、连接聚合物的方法、聚合物链的构象以及构象变化的速率［33］。细胞接种的顺序也很重要，只有在接种内皮细胞之前先接种肝细胞才能获得控制异型相互作用的合适的细胞片层［34］。在小鼠体内植入二维肝细胞片层会形成二维肝组织，并维持功能达200 d，而通过在体内结合多个细胞片层则可获得三维分层肝组织［31］。此外，通过在单层肝细胞上覆盖一层内皮细胞片层可获得混合分层细胞片层。这种混合结构中由内皮细胞分泌的ECM由于上调了整合素α和蛋白聚糖的表达而迅速改变［35］。总体而言，细胞分层技术强调了细胞－细胞之间相互作用和基质拓扑结构在增强肝细胞功能中的重要性。这些有助于制造作为肝片移植的可植入支架材料以用于微创手术;且可以缩小到原始大小的六分之一而不影响细胞的功能。

图4 内皮细胞与肝细胞分层培养过程示意图［32］Fig.4 Schematic illustration of the procedure to stratify bovine endothelial cells to the hepatocyte sheet［32］

3.3 脱细胞基质

肝组织工程的一种方法是对废弃供肝进行脱细胞化和再细胞化。脱细胞处理包括去除所有细胞或核物质，同时保留细胞外基质的机械完整性和组成［36］(见图5)。脱细胞基质表现出理想的基质特性，如ECM样的化学组成，清晰的孔隙结构和肝细胞培养中存在的流动通道。利用猪肝脏生物基质可在体外稳定培养大鼠肝细胞达45 d，表明这样的基质可能延长细胞体外培养时间［37］。现已可从不同物种获得脱肝脏细胞基质。肝细胞和内皮细胞的再细胞化使它们在其原本的位置重新定位，表达内皮细胞、肝细胞和胆管的典型标志物，从而在体外形成肝样组织［38］。

图5 肝脏脱细胞基质前(a)后(b)外观图［36］Fig.5 Gross view of a liver before(a)and after(b)decellularization［36］

从利用脱全肝脏细胞基质和200万成年大鼠肝细胞建立可移植的再细胞化肝移植体的第一份报告开始［39］，该领域已发展至利用人类肝细胞与猪肝脏脱细胞基质结合来建立重组肝移植体［40］。用脱细胞基质培养永生化人胎肝细胞和人原代肝细胞可以在植入小鼠体内后维持两种细胞达6周以上［41］。

尽管有上述进展，但移植再细胞化移植体仅能存活2～8 h，其主要原因是当血液一旦接触到暴露的胶原蛋白(理想状态下被内皮细胞覆盖)时即发生凝血反应。近期的一项研究报告在细胞化之前先用肝素包被脱细胞基质，这种支架在移植后可以存活4 d［42］。但使内皮化均一的方法和条件的优化还需进行进一步的研究。

4 药物筛选的体外肝脏模型

利用一种理想的体外模型在药物研发早期进行肝毒性筛选可以节约成本，也减少了动物实验的需要。与体内模型不同，这种体外模型由于可精确控制其实验条件而有利于进行系统研究，从而加速对药物性肝损伤机制的理解。

用于药物毒性研究的模型包括原代肝细胞的单层培养和悬浮培养、肝片、夹层培养和永生化细胞系，然而，由于它们在短期内(24～72 h)即失去肝特异性功能或表型、CYP酶的表达，因而仅适用于短期的二维培养。为防止肝细胞的去分化，模拟异质环境，并进行与体内模型相关的检测评估研究，学者们正努力研发新型的器官模型。理想的器官模型需具有以下特征中的一个或多个:三维的细胞微环境、不同类型肝细胞的共培养、可供氧的流动液体、类似体内的化学梯度、高通量、仅需接种少量细胞。Kostadinova等建立了一种长时间的三维肝细胞共培养体系，比单层培养肝细胞能更好地检测体内药物导致的毒性［29］。

在凝胶材料如基底膜、胶原蛋白、海藻酸上培养的肝细胞，已被广泛用于药物毒性测试和筛选。刘劲松等以HepG2细胞作为模型细胞，以壳聚糖/胶原混合材料制备水凝胶支架，体外构建肝(肿瘤)细胞的三维培养体系，研究三维肝肿瘤模型对临床常用的化疗药物的敏感性，发现水凝胶支架中形成的三维肝细胞骨架更接近体内肝组织，对化疗药物的敏感性降低，可用于体外筛药研究［43］。Lan等利用一种新型的三维凝胶共培养HepG2和乳腺癌细胞，并进行了药物毒性筛选的研究［44］。

虽然利用凝胶材料培养肝细胞已广泛应用，但很难标准化生产。另外，由于氧气和营养物质转运到聚集体中心仍是有待解决的问题，因而很难大规模生产。微流控反应器特别适合肝脏模型的研发，尤其是用于药物毒性试验的肝脏模型。微流控反应器可提供较大的表面积与体积比，类似体内的流体特性，以及对时间和空间要素的良好控制，这有助于调节细胞－细胞或细胞－基质间的相互作用和氧气或化学梯度。许多研究者都利用基于浓度梯度的微流控反应器进行药物筛选研究。Ye等构建了一套集成化微流控芯片系统，利用微尺度芯片通道内的层流混合和分流特征，将细胞培养、浓度梯度加样、不同小分子－细胞相互作用等集于一体，实现了对阿霉素诱导肝癌细胞(HepG2)凋亡过程的监测［45］。郑允焕等利用SU－8负性光刻胶模具和PDMS制作出双层结构的微流控细胞阵列芯片，共培养肝癌细胞、肝细胞和内皮细胞3种不同细胞，监测了不同浓度伊立替康诱导肝癌细胞凋亡的毒性作用［46］。

基于灌注的微装置已被用于培养单层细胞、球状聚集体或三维聚集体。在这些装置中培养的肝细胞形成了胆管和缝隙连接［47］。一般的灌注培养可提高和维持肝细胞较长时间的活力和功能，并上调解毒基因的表达。三维多室毛细血管膜灌注生物反应器可长期维持肝细胞功能，并已证明比二维系统能更有效促进肝细胞谱系的分化［48－49］。这些系统在适当的剪切应力和流体流速下可表达各种解毒基因，从而使之成为一个功能强大的研究药物毒性和细胞交叉作用的工具［50－51］。

为减少细胞受到的剪切应力，学者们不断修正平板生物反应器的几何形状(包括微加工沟脊)，具有类似于体内肝脏流体梯度的生物反应器已被改造用于药物毒性分析的模块［52－53］。在聚对苯二甲酸乙二酯包被的胶原蛋白圆形平板上夹层培养肝细胞可维持不同解毒酶的表达。这样的系统可用于药物筛选平台和生物人工肝的研发［54］。

以上模型均可维持和增强肝细胞活力和功能，但在将这些模型用于工厂生产广泛应用之前，需要对其进行毒性实验的交叉验证，优化维持细胞表型、基本功能如白蛋白分泌、ATP和谷胱甘肽的浓度、信号通路的维持和外源性代谢(阶段1和2)的参数水平。此外，对模型中的细胞和体内细胞全表型的比较以及对培养条件如基质和培养基组成的标准化，仍需要进一步研究［55］。

5 展望

体外肝细胞培养经历了从经典单层细胞培养模式到技术更先进的肝脏器官模型的转变，可更精确地从时间和空间控制细胞－细胞和细胞－基质间相互作用。现已建立了许多体外肝脏模型，有望作为药物毒性筛选和治疗的平台。然而，在将其用于临床实际应用之前，还需要进一步的完善和优化。目前限制细胞模型应用的一个主要因素是模型中缺乏类似于体内肝脏的单独胆汁区域。在大多数模型中，胆汁被分泌到培养基中，并可能对细胞的功能产生有害影响。微流控装置(MD)可能有助于解决此问题。这种模型可进一步提升对胆汁相关疾病的理解，并对药物发展领域产生巨大影响。随着技术的进步，有望建立类似于体内肝脏的模型，以利于创建小型实验体系如芯片实验室，加快细胞对各种刺激响应的详细研究，以解决药物筛选和临床治疗的难题。

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