子宫内膜吸刮术对着床相关因子及反复着床失败患者妊娠结局的影响

杨 丽，姜俊怡，乔鹏云，任春娥



子宫内膜吸刮术对着床相关因子及反复着床失败患者妊娠结局的影响

杨 丽，姜俊怡，乔鹏云，任春娥

目的 探讨子宫内膜吸刮术对整合素αVβ3和骨桥蛋白(OPN)水平及反复着床失败患者再次行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)临床妊娠结局的影响。方法 选取2010年9月—2013年9月于潍坊医学院附属医院生殖医学中心连续就诊的148例反复着床失败的不孕症妇女，采用随机数字表法分为试验组和对照组，各74例。试验组于再次IVF-ET周期前1个月经周期第8～10天时行子宫内膜吸刮术，对照组未行。两组患者均采用长方案超促排卵。采用免疫组化法检测两组患者着床期子宫内膜组织中整合素αVβ3和OPN的表达程度，比较两组患者的妊娠结局。结果 试验组进行吸刮术后，整合素αVβ3和OPN的表达总染色评分〔(6.4±1.2)、(6.8±1.3)分〕均高于吸刮术前〔(4.1±0.8)、(3.6±0.7)分,P<0.05〕及对照组〔(4.5±0.8)、(3.7±0.8)分,P<0.05〕。试验组和对照组妊娠患者的整合素αVβ3和OPN表达总染色评分均高于非妊娠患者，差异有统计学意义(P<0.05)。试验组临床妊娠率、胚胎着床率及继续妊娠率分别为41.9%(31/74)、22.6%(42/186)、37.8%(28/74)，高于对照组的21.6%(16/74)、11.5%(21/183)、17.6%(13/74)(P<0.05)。结论 整合素αVβ3和OPN与胚胎着床密切相关，子宫内膜吸刮术可增强二者的表达，增加子宫内膜容受性，提高胚胎着床率，从而改善反复着床失败患者行再次IVF-ET的妊娠结局。

胚胎植入；刮宫术；整合素αVβ3；骨桥蛋白质；体外受精；胚胎移植

杨丽，姜俊怡，乔鹏云，等.子宫内膜吸刮术对着床相关因子及反复着床失败患者妊娠结局的影响[J].中国全科医学，2015，18(14)：1655-1659,1662.[www.chinagp.net]

Yang L,Jiang JY,Qiao PY,et al.Influence of endometrial suction curettage on correlation factors for implantation and pregnancy in women with repeated implantation failure[J].Chinese General Practice，2015，18(14)：1655-1659,1662.

随着辅助生殖技术的不断发展，体外培养胚胎技术的不断成熟以及临床促排卵技术的发展，使得体外受精-胚胎移植(IVF-ET)的成功率不断提高，但其着床率仍在30%左右[1-2]。反复着床失败是指优质胚胎移植3次以上或多次移植胚胎数量总计超过10枚仍未妊娠者。很多夫妇反复助孕失败，对其经济及心理造成极大负担。IVF-ET着床失败的患者中约有2/3由子宫内膜容受性不良导致[3-4]，故如何提高子宫内膜容受性对IVF-ET成功至关重要。本研究对反复着床失败患者于再次IVF-ET周期前行子宫内膜吸刮术，检测着床期子宫内膜中整合素αVβ3和骨桥蛋白(OPN)的表达，分析其表达水平与妊娠结局的关系，进一步探讨子宫内膜吸刮术提高子宫内膜容受性的价值。

1 资料与方法

1.1 病例纳入标准 (1)有3次及以上移植优质胚胎着床失败并再次拟进入IVF-ET周期。(2)心、肝、肾、甲状腺等重要脏器均无明显异常。(3)年龄<40岁，近3个月内无子宫腔内有创或无创操作史，且有规律排卵。(4)双侧卵巢窦卵泡数量>5个，基础卵泡刺激素(FSH)<10 U/L。

1.2 病例排除标准 (1)近3个月内有避孕药或激素类药物服用史。(2)宫腔粘连、急性生殖道感染、子宫畸形、输卵管积水及结核病史。

1.3 一般资料 选取2010年9月—2013年9月于潍坊医学院附属医院生殖医学中心行IVF-ET的患者148例，采用随机数字表法将患者分为试验组和对照组，每组各74例。试验组患者于再次进入IVF-ET周期前1个月经周期第8～10天时行子宫内膜吸刮术，而对照组未行。试验组和对照组患者年龄、不孕时间比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表1)，资料具有可比性。所有患者签署知情同意书，本研究经过本院伦理委员会批准。

1.4 子宫内膜吸刮术及子宫内膜标本取材 子宫内膜吸刮术：试验组患者再次进入IVF-ET周期前1个月经周期第8～10天时，采用一次性宫腔组织吸引管(上海市家宝医学科技有限公司生产，TY-C3.1/30-1S型)，将吸管置入宫腔后内芯拔出7 cm，利用其负压及多孔套管吸刮宫腔1周，由专人操作实施。

子宫内膜标本取材:两组患者均进入IVF-ET周期前3个月经周期及1个月经周期时，于排卵后第7天采用微活检术获取子宫内膜，分别行组织学HE染色和免疫组化染色。

1.5 控制性超促排卵方案 患者均采用长方案超促排卵。自然周期经阴道超声监测排卵，排卵后第7天给予促性腺激素释放激素激动剂达菲林0.1 mg，1次/隔日,2周后如达到降调标准，改为0.1 mg，1次/d至注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)日，同时使用促性腺激素(Gn)进行超促排卵，当最大卵泡直径大于2.0 cm、3个卵泡直径>1.8 cm当日22:00肌肉注射HCG 4 000～8 000 U，注射HCG后34～36 h取卵，取卵后3 d选择评分最高的2～3个胚胎进行移植。取卵术后肌肉注射黄体酮60 mg/d进行黄体支持。

1.6 免疫组化检测 两组患者取子宫内膜组织进行常规石蜡包埋，采用组织切片机进行切片，厚度为4.0 μm，常规HE染色。采用SABC染色法，按照免疫组化试剂盒(上海明睿生物有限公司)说明书进行操作。组织切片常规脱蜡、水化、抗原修复、封闭。滴加兔抗整合素αVβ3多克隆IgG抗体(公司浓度)、兔抗OPN单克隆IgG抗体(公司浓度)，4 ℃孵育过夜；滴加二抗，室温孵育30 min；DAB显色，镜下控制显色时间。最后苏木素复染、透明、中性树胶封固。

表1 两组患者一般资料比较

注：Gn=促性腺激素，FSH=卵泡刺激素，LH=黄体生成素，HCG=人绒毛膜促性腺激素，IVF=体外受精，ICSI=卵胞浆内单精子注射

1.7 免疫组化染色结果判定 随机选取切片中的5个视野，观察阳性细胞的表达强度，无染色记为“0分”，弱染色记为“1分”，中等染色记为“2分”，强染色记为“3分”。同时根据染色阳性细胞占细胞总数的百分比计分：无、1%～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%分别计为0、1、2、3、4分。将两者评分相乘即为标本的总染色评分(H-score)。每例标本的评分均由2位研究者同时观察判定。

1.8 观察指标 (1)胚胎种植率=种植胚胎总数/移植胚胎总数×100%。(2)临床妊娠率=B超确诊妊娠患者数/总患者数×100%。(3)继续妊娠率=妊娠12周时胚胎发育的患者数/总患者数×100%。

2 结果

2.1 一般资料比较 两组Gn使用天数、Gn使用总量、基础FSH、基础黄体生成素(LH)、HCG日子宫内膜厚度、受精方式、平均取卵数、不孕因素、移植胚胎数和移植胚胎评分间差异均无统计学意义(P>0.05，见表1)，资料具有可比性。

2.2 整合素αVβ3和OPN表达H-score比较 试验组进行吸刮术后，整合素αVβ3和OPN表达H-score较术前及对照组均增加(P<0.05)；对照组两次活检，整合素αVβ3和OPN表达H-score间差异无统计学意义(P>0.05，见表2)。

试验组吸刮术前及吸刮术后整合素αVβ3和OPN免疫组化染色显示，整合素αVβ3表达于子宫内膜腔上皮和腺上皮中，在胞质中可以看到褐色染色颗粒，治疗前整合素αVβ3表达较弱，吸刮术后整合素αVβ3表达显著增强(见图1)。OPN主要表达于子宫内膜表面细胞和腺上皮细胞，吸刮术后可见胞质中棕褐色染色颗粒遍布，染色较深，表达较治疗前显著增强。

Table 2 Comparison of H-score of αVβ3 and OPN between the two groups

组别例数整合素αVβ3第1次 第2次OPN第1次 第2次对照组744.3±0.84.5±0.8 3.4±0.73.7±0.8 试验组744.1±0.86.4±1.2*△3.6±0.76.8±1.3*t值0.6172.5620.7032.618P值0.5320.0140.4640.012

注：与第1次比较，*P<0.05；与对照组比较，△P<0.05；H-score=总染色评分，OPN=骨桥蛋白

注：A试验组吸刮术前整合素αVβ3的表达，B试验组吸刮术后整合素αVβ3的表达，C试验组吸刮术前OPN的表达，D试验组吸刮术后OPN的表达

图1 试验组吸刮术前后整合素αVβ3和OPN免疫组化染色(SABC法，×100)

Figure 1 Immunohistochemical staining of ntegrinαVβ3 and OPN before and after suction curettage in experimental group

2.3 妊娠与子宫内膜整合素αVβ3和OPN表达的关系 将两组患者根据是否妊娠分为妊娠和非妊娠亚组，试验组和对照组妊娠患者第2次检测整合素αVβ3和OPN表达H-score均高于非妊娠患者(P<0.05，见表3)。

表3 整合素αVβ3和OPN表达H-score与妊娠的关系分)

2.4 两组妊娠结局比较 试验组患者临床妊娠率、继续妊娠率均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，见表4)。试验组胚胎种植率为22.6%(42/186)，高于对照组的11.5%(21/183)，差异有统计学意义(χ2=12.188，P<0.05)。

表4 两组妊娠结局比较〔n(%)〕

3 讨论

3.1 子宫内膜吸刮术对整合素αVβ3和OPN表达的影响 胚胎着床涉及多个步骤和环节，如囊胚孵出后定位、黏附、穿过基底膜侵入子宫内膜基质并植入。胚胎的成功着床取决于胚胎的质量和子宫内膜的容受性。因此胚胎和子宫内膜的同步生长发育也是着床的必要条件。有研究表明对反复胚胎着床失败的患者行子宫内膜搔刮术或修整术，可提高其胚胎着床率及临床妊娠率[5-7],Chen等[8]认为，对子宫内膜行机械刺激可导致内膜蜕膜化。本研究试验组74例患者再次进入IVF-ET周期前1个月经周期第8～10天时行子宫内膜吸刮术，对子宫内膜形成轻微的机械性损伤，促使子宫内膜的快速生长。为进一步分析子宫内膜吸刮术与妊娠率的关系，本研究对两组患者的子宫内膜组织整合素αVβ3和OPN进行了免疫组化检测，结果显示试验组进行吸刮术后，整合素αVβ3和OPN表达均显著高于吸刮术前及对照组，而对照组整合素αVβ3和OPN表达未见改变；且试验组吸刮术后可见胞质中棕褐色染色颗粒遍布，染色较深。吸刮术手法较轻，这种方法本身可以刮去子宫内膜病灶组织及不规则增生的内膜组织，能够促进基质细胞和上皮细胞的增殖和分化，促进子宫内膜螺旋动脉大量生成而发生血管化，丰富子宫内膜的血流，这些因素均能够帮助优质胚胎顺利着床。研究表明，机械性刺激子宫内膜可增加子宫内膜容受性，大幅度提高胚胎着床率[9-11]。李权等[12]研究表明，机械刺激C型子宫内膜能够促进胞饮突的发育。

3.2 妊娠与子宫内膜整合素αVβ3和OPN的表达 本研究结果发现，试验组患者临床妊娠率和胚胎着床率分别高达41.9%和22.6%，显著高于对照组。这也表明轻度的吸刮对改善妊娠结局具有重要临床价值。对比两组妊娠与非妊娠患者整合素αVβ3和OPN表达发现，试验组和对照组妊娠患者的整合素αVβ3和OPN的表达显著高于非妊娠患者。这也提示整合素αVβ3和OPN的高表达预示着子宫容受性的提高，与临床妊娠率密切相关。整合素αVβ3广泛存在于人体多种组织细胞中，由两个亚单位组成，主要参与细胞及细胞外基质、细胞之间的相互作用。目前研究表明，整合素αVβ3水平能够较好地评价子宫内膜容受性[13]。OPN是包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸整合素结合区的磷酸化糖蛋白，其能够参与细胞黏附、细胞募集、信号转导等作用。OPN也是近年来被发现与子宫内膜容受性相关的细胞因子之一，其具有整合素结合域，可与整合素αVβ3结合后，通过信号转导调控细胞增殖及分化。OPN与整合素αVβ3的协调配合在胚胎着床中发生重要的作用。研究表明，子宫内膜整合素αVβ3和OPN水平较低，子宫内膜容受性较低[14]。

3.3 子宫内膜吸刮术的方法和可行性分析 本研究采用的子宫内膜吸刮术与常规的机械性刺激子宫内膜不同，使用直径3.1 mm的一次性宫腔组织负压吸引管，此管纤细，质地柔软，无需扩张及钳夹宫颈，过程简单，抽吸压力低，对子宫内膜基底层不会造成损伤，移植无宫腔积液，内膜修复完善，故患者易于接受。子宫内膜吸刮术在胚胎移植前1周期进行，可给予内膜足够的修复时间，利于子宫内膜充分血管化，基质充分水肿增厚，利于胚胎与之完成黏附、侵入、种植。

综上所述，整合素αVβ3和OPN与胚胎着床密切相关，子宫内膜吸刮术能够提高其表达水平，从而改善反复着床失败患者临床妊娠率，改善妊娠结局。

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(本文编辑：赵跃翠)

Influence of Endometrial Suction Curettage on Correlation Factors for Implantation and Pregnancy in Women With Repeated Implantation Failure

YANGLi,JIANGJun-yi,QIAOPeng-yun,etal.

WeifangMedicalCollege,Weifang261031,China

Objective To investigate the influence of endometrial scratching on the expression of integrin αVβ3 and osteopontin.Demonstrating the relationship with IVF-ET pregnancy outcomes in patients with repeated implantation failure.Methods A total of 148 cases of infertility women with infertility and repeated implantation failure who received continuous treatment in the Reproductive Medicine Center in Affiliated Hospital of Weifang Medical University from September 2010 to September 2013 were enrolled and divided into trial group(n=74) and control group(n=74) using random number table.Trial group operated endometrial scratching before performed IVF-ET,while control group did not undergo endometrial scratching.The wo groups were treated with long protocol controlled ovarian hyperstimulation.The expression of integrin αVβ3 and OPN were detected by immunohistochemistry before and after patients undergoing endometrial scratching/biopsy.Pregnancy outcomes were also compared between these two groups.Results After performing endometrial scratching in experimental group,the expression H-score of integrin αVβ3 and OPN were significantly higher than surgery before〔(6.4±1.2)vs.(4.1±0.8)；(6.8±1.3)vs.(3.6±0.7),P<0.05〕 and control group〔(6.4±1.2)vs.(4.5±0.8)；(6.8±1.3)vs.(3.7±0.8),P<0.05〕.In these two groups,we also observed that the expression H-score of integrin αVβ3 and OPN were significantly higher in patients with postoperative pregnancy than non-pregnant (P<0.05).Besides,clinical pregnancy rate,embryo implantation rate and ongoing pregnancy rate of experimental group were 41.9%(31/74)、22.6%(42/186)、37.8%(28/74),which were significantly higher than control group of 21.6%(16/74)、11.5%(21/183)、17.6%(13/74)(P<0.05).Conclusion Endometrial scratching markedly promoted the expression of integrin αVβ3 and OPN,which are important factors related to embryo implantation.Therefore,endometrial scratching could increase endometrial receptivity,embryo implantation and thus enhanced the rate of IVF-ET pregnancy.

Embryo implantation；Dilatation and curettage；Integrin αVβ3;Osteopontin;Fertilization in vitro；Embryo transfer

山东省科技发展计划项目(2012YD18069)

261031山东省潍坊市，潍坊医学院(杨丽)；潍坊医学院附属医学院(姜俊怡，乔鹏云，任春娥)

任春娥，261031山东省潍坊市，潍坊医学院附属医院；E-mail：wyfybaby@126.com

R 615 R 714.24

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.14.013

;2014-11-20;

2015-01-20)