成人特发性膜性肾病与分泌型磷脂酶A2-ⅠB及抗磷脂酶A2受体抗体的相关性研究

杨雪芬，潘阳彬，丁国华，万建新，马屹茕，杨红霞



·论著·

成人特发性膜性肾病与分泌型磷脂酶A2-ⅠB及抗磷脂酶A2受体抗体的相关性研究

杨雪芬，潘阳彬，丁国华，万建新，马屹茕，杨红霞

目的 探讨成人特发性膜性肾病(IMN)与分泌型磷脂酶A2-ⅠB(sPLA2-ⅠB)、抗磷脂酶A2受体抗体(Anti-PLA2R AB)的相关性。方法 选取2013年7—12月武汉大学人民医院、福建医科大学附属第一医院经肾活检证实的成人IMN、继发性膜性肾病(SMN)患者共30例，其中IMN 20例、SMN 10例，另选取同时期体检健康的志愿者5例为对照组。根据24 h尿蛋白总量分为低蛋白尿组7例、中蛋白尿组11例、高蛋白尿组17例。酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清sPLA2-ⅠB水平；免疫组化法检测肾脏sPLA2-ⅠB表达；间接免疫荧光法检测血清Anti-PLA2R AB表达。结果 IMN组和SMN组血清sPLA2-ⅠB水平高于对照组(P<0.05)；IMN组与SMN组血清sPLA2-ⅠB水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。IMN和SMN患者血清sPLA2-ⅠB水平与年龄、24 h尿蛋白总量呈正相关(r值分别为0.475和0.581，P值分别为0.008和0.002)，与血清总蛋白、清蛋白呈负相关(r值分别为-0.487和-0.473，P值分别为0.009和0.011)；多元线性回归分析结果显示，年龄、24 h尿蛋白总量与血清sPLA2-ⅠB水平呈独立正相关(P<0.05)。高蛋白尿组血清sPLA2-ⅠB水平、sPLA2-ⅠB阳性区域面积占肾小球区域面积比例高于低蛋白尿组和中蛋白尿组，中蛋白尿组血清sPLA2-ⅠB水平、sPLA2-ⅠB阳性区域面积占肾小球区域面积比例高于低蛋白尿组(P<0.05)。IMN组Anti-PLA2R AB表达阳性率60%(12/20)高于SMN组的20%(2/10)(P=0.039)。结论 年龄、24 h尿蛋白总量与血清sPLA2-ⅠB水平呈独立正相关，血清sPLA2-ⅠB水平可能与IMN病情有一定相关性；IMN患者血清Anti-PLA2R AB阳性率高于SMN患者，提示Anti-PLA2R AB可能是IMN的特异性抗体,且有助于IMN与SMN的鉴别诊断。

肾小球肾炎,膜性；ⅠB型磷脂酶A2；受体,磷脂酶A2

杨雪芬，潘阳彬，丁国华，等.成人特发性膜性肾病与分泌型磷脂酶A2-ⅠB及抗磷脂酶A2受体抗体的相关性研究[J].中国全科医学，2015，18(9)：1018-1022,1028.[www.chinagp.net]

Yang XF,Pan YB,Ding GH,et al.Correlation of secreted phospholipase A2-ⅠB,anti-phospholipase A2 receptor antibody with idiopathic membranous nephropathy among adult patients [J].Chinese General Practice，2015，18(9)：1018-1022,1028.

膜性肾病是成人肾病综合征常见病理类型，其中病因未明者称为特发性膜性肾病(idiopathic membranous nephropathy,IMN)，占原发性肾病综合征的30%～40%[1]。目前，其诊断与鉴别诊断的金标准仍是病理组织学，属于有创性检查手段。膜性肾病临床表现轻重不一，预后差别也较大，其中40%的患者10年内会发展为肾衰竭[2]。为了研发更为有效的诊断、治疗及监测手段，其分子发病机制一直以来均是研究的热点。1959年Heymann肾炎大鼠模型[3]的建立开启了膜性肾病发病机制的研究。2009年，Beck等[4]在成人IMN患者血清中检测到抗M型磷脂酶A2受体(M-type phospholipase A2 receptor，M-type PLA2R)的自身抗体，且其水平与临床蛋白尿相关，提示PLA2R可能是IMN的靶抗原。分泌型磷脂酶A2-ⅠB (secreted phospholipase A2-ⅠB，sPLA2-ⅠB)是PLA2R的天然配体。有研究表明，sPLA2-ⅠB与PLA2R结合后能激活细胞内丝裂原活化蛋白激(MAPK)系统、磷酸肌醇3激酶/碱性磷酸酶(PI3K/AKP)系统等引起细胞内胞质型磷脂酶A2(cPLA2)生成增加，后者增加会加重甘油磷脂的水解，产生花生四烯酸(AA)、前列腺素(PG)、白三烯(LTs)等，这些炎性递质会进一步破坏细胞膜及细胞器，应用PLA2R阻断剂的细胞则损伤明显减轻[5]。另有研究证实，经sPLA2-ⅠB处理后的大鼠肾小球系膜细胞导致sPLA2-ⅡA和环氧合酶2(COX-2)表达增加，可能原因是sPLA2-ⅠB与其特异性M-ypte PLA2R结合所致[6]。M-ypte PLA2R是否为IMN的靶抗原，sPLA2-ⅠB是否参与IMN的发病机制，这些问题仍有待进一步探讨。为此，本研究选取IMN及继发性膜性同行评议：

本研究探讨了成人特发性膜性肾病(IMN)与抗磷脂酶A2受体抗体(Anti-PLA2R AB)、分泌型磷脂酶A2-ⅠB(sPLA2-ⅠB)的相关性，结果提示，Anti-PLA2R AB可能是IMN的特异性抗体，有助于IMN与继发性膜性肾病(SMN)的鉴别诊断。选题较新，设计合理。

肾病(SMN)患者，探讨中国成人IMN与sPLA2-ⅠB及抗磷脂酶A2受体抗体(Anti-PLA2R AB)的相关性，并进一步探讨sPLA2-ⅠB 与各临床指标的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2013年7—12月武汉大学人民医院、福建医科大学附属第一医院经肾活检证实的成人IMN、SMN患者共30例为研究对象，其中男18例，女12例；年龄22～78岁，平均(49.7±16.5)岁；IMN 20例，SMN 10例；除1例IMN患者外均为首次肾活检确诊患者，IMN组中合并高血压5例(病程2～20年)，SMN组中合并高血压3例(病程1～3年)。患者均无糖尿病、冠心病等其他慢性疾病史；患者均无肾毒性药物、激素及免疫抑制剂应用史；近期无尿路感染病史，无严重心、脑、肺、血液系统疾病等。另选取同时期体检健康的志愿者5例为对照组。本研究遵循伦理学标准，均签署知情同意书。

1.2 临床资料收集 包括性别、年龄、血清总蛋白、清蛋白、尿素氮、肌酐、总胆固醇、三酰甘油、补体C3、补体C4、24 h尿蛋白总量等。

1.3 标本采集 收集患者晨起空腹静脉血3 ml，离心机3 000 r/min(离心半径13.5 cm)，低温离心5 min，分离血清，置于-70 ℃冰箱待用，避免反复冻融。收集患者肾活检标本，制成石蜡切片后于4 ℃冰箱保存。

1.4 双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清sPLA2-ⅠB水平 采用Elabscience公司生产的试剂盒，根据试剂盒说明书进行操作。准备试剂、样品和标准品，加入准备好的样品和标准品，加入生物素化抗体工作液，37 ℃孵育60 min。洗涤3次，加入酶结合物工作液，37 ℃孵育30 min。洗涤5次，加入底物溶液，37 ℃孵育15 min，加入终止液，10 min内读取吸光度值(OD值)，根据曲线回归方程，计算血清sPLA2-ⅠB水平。

1.5 免疫组化法检测肾脏sPLA2-ⅠB表达 肾组织以10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，3 μm切片后常规脱蜡、梯度乙醇水化，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后加入枸橼酸抗原修复液室温孵育10 min，PBS清洗3次，过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，PBS清洗3次后正常血清封闭，滴加适当比例稀释的抗sPLA2-ⅠB抗体(1∶100)，4 ℃冰箱过夜，37 ℃复温30 min，PBS清洗3次，加入相应的二抗，37 ℃孵育20 min，PBS清洗3次。DBA显色，苏木素复染，树脂封片后显微镜下观察。光镜下每张切片随机选择5个视野，采用Image-ProPlus 6.0软件对结果进行分析。

1.6 间接免疫荧光法(IIF)检测Anti-PLA2R AB水平 采用北京欧蒙生物技术有限公司生产的抗磷脂酶A2受体抗体检测试剂盒(Anti-phospholipase A2 receptor IIFT)，试剂批号：FA1254-50、F130409DL、F131130DB、F131121VA。采用转染了PLA2R的HK293细胞，IIF检测患者血清抗PLA2R抗体。血清稀释后与抗原基质片室温孵育30 min (同时设阳性和阴性对照)，清洗5 min，再加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗人IgG，室温避光孵育30 min，清洗5 min，加甘油封片后荧光显微镜下判读结果，以抗体滴度≥1∶10为弱阳性，抗体滴度≥1∶320为强阳性，介于两者之间者为阳性。

2 结果

2.1 3组临床指标比较 3组性别、年龄及血清尿素氮、肌酐、三酰甘油、补体C3、补体C4水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。3组血清总蛋白、清蛋白、24 h尿蛋白总量、总胆固醇水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中IMN组及SMN组患者血清总蛋白、清蛋白水平低于对照组，24 h尿蛋白总量、总胆固醇水平高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；IMN组与SMN组患者血清总蛋白、清蛋白、24 h尿蛋白总量、总胆固醇水平比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。

2.2 3组血清sPLA2-ⅠB水平比较 3组血清sPLA2-ⅠB水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中IMN组和SMN组高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；IMN组与SMN组比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表2)。

2.3 IMN、SMN患者血清sPLA2-ⅠB水平与各临床指标的相关性分析 Pearson相关分析结果显示，血清sPLA2-ⅠB水平与年龄、24 h尿蛋白总量呈正相关(r值分别为0.475和0.581，P值分别为0.008和0.002)，与血清总蛋白、清蛋白呈负相关(r值分别为-0.487和-0.473，P值分别为0.009和0.011)，与尿素氮、肌酐、总胆固醇、三酰甘油、补体C3、补体C4无直线相关关系(r值分别为-0.027、-0.190、0.273、-0.186、-0.055和-0.012，P值分别为0.893、0.332、0.177、0.362、0.793和0.954)。多元线性回归分析结果显示，年龄、24 h尿蛋白总量与血清sPLA2-ⅠB水平呈独立正相关(P<0.05，见表3)。

表1 3组临床指标比较

注：IMN=特发性膜性肾病，SMN=继发性膜性肾病；-采用Fisher确切概率法；与对照组比较，*P<0.05

2.4 血清sPLA2-ⅠB水平与24 h尿蛋白总量的关系 将IMN、SMN患者及对照组按照24 h尿蛋白总量分为3组，低蛋白尿组24 h尿蛋白总量<1.00 g,高蛋白尿组24 h尿蛋白总量≥3.50 g,中蛋白尿组24 h尿蛋白总量介于两者之间。3组血清sPLA2-ⅠB水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中，高蛋白尿组血清sPLA2-ⅠB水平高于低蛋白尿组和中蛋白尿组，中蛋白尿组血清sPLA2-ⅠB水平高于低蛋白尿组，差异有统计学意义(P<0.05，见表4)。

Table 2 Comparison of serum sPLA2-ⅠB among the three groups

组别例数sPLA2-ⅠB对照组 5 3.19±0.25IMN组209.68±3.39*SMN组107.81±3.70*F值8.019P值0.002

注：sPLA2-ⅠB=分泌型磷脂酶A2-ⅠB；与对照组比较，*P<0.05

表3 IMN和SMN患者血清sPLA2-ⅠB水平与各临床指标关系的多元线性回归分析

Table 3 Correlation of serum sPLA2-ⅠB level with various clinical indicators in IMN and SMN patients:a multivariate linear regression analysis

指标βt值P值年龄0.1283.2520.00424h尿蛋白总量0.5943.0640.006总蛋白-0.179-1.3180.202清蛋白0.2721.3040.207

Table 4 Comparison of serum sPLA2-ⅠB among low proteinuria group,middle proteinuria group and high proteinuria group

组别例数sPLA2-ⅠB低蛋白尿组73.62±0.87中蛋白尿组116.64±1.58*高蛋白尿组1711.14±3.19*△F值26.633P值<0.001

注：与低蛋白尿组比较，*P<0.05；与中蛋白尿组比较，△P<0.05

2.5 低蛋白尿组、中蛋白尿组、高蛋白尿组肾脏sPLA2-ⅠB表达情况 低蛋白尿组肾脏免疫组化染色淡黄色(见图1a)，高蛋白尿组染色为棕褐色(见图1c)，中蛋白尿组染色深度介于低蛋白尿组、高蛋白尿组之间(见图1b)。Image-ProPlus 6.0分析计算sPLA2-ⅠB阳性区域面积占肾小球区域面积比例，结果显示，3组sPLA2-ⅠB阳性区域面积占肾小球区域面积比例比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中，高蛋白尿组高于低蛋白尿组和中蛋白尿组，中蛋白尿组高于低蛋白尿组，差异有统计学意义(P<0.05，见表5)。

Table 5 Comparison of the proportion of sPLA2-ⅠB positive area to total glomerulus area among low proteinuria group,middle proteinuria group and high proteinuria group

组别例数sPLA2-ⅠB阳性区域面积占肾小球区域面积比例低蛋白尿组79.32±1.60中蛋白尿组1131.76±6.03*高蛋白尿组1758.27±6.52*△F值110.63P值<0.001

注：与低蛋白尿组比较，*P<0.05；与中蛋白尿组比较，△P<0.05

注：a为低蛋白尿组,b为中蛋白尿组,c为高蛋白尿组

图1 低蛋白尿组、中蛋白尿组、高蛋白尿组肾脏sPLA2-ⅠB表达情况(免疫组化染色，×400)

Figure 1 The expression of sPLA2-ⅠB in kidney among low proteinuria group,middle proteinuria group and high proteinuria group

2.6 IIF检测血清Anti-PLA2R AB表达 IMN组Anti-PLA2R AB表达阳性者12例(60%)，其中强阳性4例，阳性6例，弱阳性2例；SMN组Anti-PLA2R AB表达阳性者2例(20%)，其中阳性1例，弱阳性1例。IMN组Anti-PLA2R AB表达阳性率高于SMN组，差异有统计学意义(P=0.039)。

3 讨论

成人IMN的发病机制一直以来均是全球研究热点，人类肾小球足细胞M-type PLA2R及其抗体的发现将人们对IMN发病机制的认识带入了一个崭新的领域。PLA2表达于所有有核细胞，是一个脂溶性水解酶超家族，分为分泌型磷脂酶A2(secreted PLA2,sPLA2)、cPLA2及非钙依赖型磷脂酶A2(Ca2+-independent PLA2,iPLA2)3大类，每一类又包括多种亚型，其中sPLA2有11种亚型(ⅠB、ⅡA、ⅡC、ⅡD、ⅡE、ⅡF、Ⅲ、Ⅴ、Ⅹ、ⅫA及ⅫB)[5]。血浆或组织中的sPLA2可通过水解膜磷脂参与炎性反应，每种亚型对应不同的靶目标膜，sPLA2-ⅠB是研究较为成熟的一种。有研究证实经sPLA2-ⅠB处理后的大鼠肾小球系膜细胞导致sPLA2-ⅡA和COX-2表达增加，可能原因是sPLA2-ⅠB与其特异性M-tyype PLA2R结合所致[6]。那么，sPLA2-ⅠB是否是成人IMN发病机制中的重要成分呢？本研究结果显示，IMN组、SMN组血清sPLA2-ⅠB水平高于对照组，IMN组与SMN组无差异。sPLA2-ⅠB在IMN中没有明显特异性，在IMN与SMN的鉴别诊断中可能意义不大。本研究对sPLA2-ⅠB与临床指标相关性进行分析，结果显示，sPLA2-ⅠB与患者年龄、24 h尿蛋白总量呈正相关，与患者血清总蛋白、清蛋白呈负相关。进一步行多元线性回归分析结果显示，年龄、24 h尿蛋白总量与血清sPLA2-ⅠB水平呈独立正相关关系，可见血清sPLA2-ⅠB水平与24 h尿蛋白总量之间存在密切相关性，提示其可能与膜性肾病病情发展有一定相关性。由于缺乏特异性临床指标，目前治疗膜性肾病采用何种治疗方案及治疗时间长短，临床多依据患者24 h尿蛋白总量变化来进行调整，如果血清sPLA2-ⅠB水平与患者病情发展有一定相关性，那么将对膜性肾病的诊治意义重大。但由于本研究纳入病例数有限，且没有进行临床随访研究，血清sPLA2-ⅠB水平是否与患者病情发展存在密切关系目前仍不能确定。

M-type PLA2R是甘露醇受体家族中的一种，属于Ⅰ型跨膜糖蛋白，相对分子质量为180 000。其结构包括：(1)细胞外部分，由富含半胱氨酸的N末端、Ⅱ型纤维连接蛋白域、八个串联的C型外源性凝集素样部分(CRD)组成；(2)1个跨膜域；(3)细胞内C末端[7]。PLA2R 细胞外结构中结合sPLA2的关键部位是CRD[8]。既往研究显示，52%～82%的IMN患者血清中可检出Anti-PLA2R AB[9-13]。本研究结果显示，IMN组Anti-PLA2R AB表达阳性率为60%，高于SMN组Anti-PLA2R AB表达阳性率(20%)，Anti-PLA2R AB可能为IMN特异性致病抗体，且有助于成人IMN的诊断及鉴别诊断。此外，既往研究通过检测血清Anti-PLA2R AB及肾组织PLA2R分布情况，发现血清与肾组织的敏感性并不完全一致[14-15]，因此血清Anti-PLA2R AB检测阴性者也不能排除IMN的可能。近期1项纳入9篇文献，2 212例患者的Meta分析从另一方面证实了该结论，该系统分析结果显示，血清检测Anti-PLA2R AB的灵敏度为78%，特异度为99%[16]。Hoxha等[17]对133例肾活检为膜性肾病且血清检测Anti-PLA2R AB阳性的患者进行长达2年的随访，结果显示，初始检测血清Anti-PLA2R AB水平较低，患者达到临床蛋白尿缓解期所需时间较短，所有达到临床蛋白尿缓解期患者其血清Anti-PLA2R AB水平均有显著降低，而Anti-PLA2R AB水平的降低在治疗前3个月下降最明显，且其水平下降早于临床蛋白尿水平下降。Segarra-Medrano等[18]对以他克莫司治疗的36例膜性肾病患者进行了1年随访，得到了与Hoxha等[17]相同的结论。因此，认为检测血清Anti-PLA2R AB水平对IMN病情监测及预测IMN临床缓解率及缓解时间有帮助。

综上所述，本研究探讨成人IMN与sPLA2-ⅠB的相互关系，且发现与对照组相比，IMN与SMN患者血清sPLA2-ⅠB水平升高。相关及多元线性回归分析显示，年龄、24 h尿蛋白总量与血清sPLA2-ⅠB水平呈独立正相关关系。进一步研究显示，大量蛋白尿患者肾脏足细胞sPLA2-ⅠB表达明显增多，因此认为血清sPLA2-ⅠB水平可能与IMN病情有一定相关性。此外，进一步验证了成人IMN患者血清Anti-PLA2R AB阳性率明显高于SMN组，表明Anti-PLA2R AB可能是成人IMN的特异性抗体,且有助于IMN与SMN的鉴别诊断。但由于本研究样本量有限，且未对纳入患者进行临床随访研究，血清sPLA2-ⅠB及Anti-PLA2R AB水平是否与成人IMN患者病情发展存在密切关系目前仍不能确定。

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(本文编辑：陈素芳)

Correlation of Secreted Phospholipase A2-ⅠB,Anti-phospholipase A2 Receptor Antibody with Idiopathic Membranous Nephropathy among Adult Patients

YANGXue-fen,PANYang-bin,DINGGuo-hua,etal.

DepartmentofNephrology,thePeople′sHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China

Objective To investigate the correlation of secreted phospholipase A2-ⅠB (sPLA2-ⅠB) and anti-phospholipase A2 receptor antibody (Anti-PLA2R AB) with idiopathic membranous nephropathy(IMN) in adult patients.Methods 20 adult patients with IMN,and 10 adult patients with secondary membranous nephropathy (SMN) who were admitted to the People′s Hospital of Wuhan University and the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University from July to December in 2013,were selected as study subjects,the diseases of cases were confirmed by renal biopsy,5 healthy volunteers were included in control group at the same time.The enrolled cases were divided into low proteinuria group (7 cases),middle proteinuria group (11 cases)and high proteinuria group (17 cases) according to 24-hour proteinuria.Serum sPLA2-ⅠB level was assessed by ELISA,the expression of sPLA2-ⅠB in kidney was detected by immunohistochemistry.Serum Anti-PLA2R AB level was detected by the indirect immunofluorescence test.Results Serum sPLA2-ⅠB level in IMN group and in SMN group was significantly higher than that in control group,respectively (P<0.05).There was no significant difference in serum sPLA2-ⅠB level between IMN group and SMN group (P>0.05).For IMN patients and SMN patients,the concentration of serum sPLA2-ⅠB was positively correlated with age and 24-hour proteinuria,respectively (r=0.475,P=0.008;r=0.581,P=0.002),and was negatively correlated with serum total protein and serum albumin,respectively (r=-0.487,P=0.009;r=-0.473，P=0.011).According to the results of multivariate linear regression analysis,age and 24-hour proteinuria was independently correlated with serum sPLA2-ⅠB level,respectively (P<0.05).The concentration of serum sPLA2-ⅠB and the proportion of sPLA2-ⅠB positive area to total glomerulus area in high proteinuria group were significantly higher than those in middle proteinuria group and in low proteinuria group,respectively(P<0.05),and the above two indicators in middle proteinuria group were significantly higher than those in low proteinuria group,respectively (P<0.05).The expression rate of Anti-PLA2R AB in IMN group was 60% (12/20),which was significantly higher than that (20%,2/10) in SMN group (P=0.039).Conclusion Age and 24-hour proteinuria were independent influence factors for concentration of serum sPLA2-ⅠB.The level of serum sPLA2-ⅠB is possibly correlated with the progress of IMN.The expression rate of Anti-PLA2R AB among IMN patients is significantly higher than that among SMN patients,which indicates that Anti-PLA2R AB maybe the specific antibody of IMN,and Anti-PLA2R AB may contribute to the differential diagnosis of IMN and SMN.

Glomerulonephritis,membranous；Group ⅠB phospholipases A2；Receptors,phospholipase A2

国家自然科学基金资助项目(81270762)

430060 湖北省武汉市，武汉大学人民医院肾内科(杨雪芬，潘阳彬，丁国华，马屹茕，杨红霞)；福建医科大学附属第一医院肾内科(万建新)

丁国华，430060 湖北省武汉市，武汉大学人民医院肾内科；E-mail:ghxding@gmail.com

R 692

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.09.009

2014-09-24；

2015-01-06)