血小板源性生长因子和血小板源性内皮细胞生长因子在内皮细胞和血管平滑肌细胞中的作用研究

朱晋坤，毛 华，尹扬光，董 文，杜 峰，鲁玉明，熊宗华，邓梦扬



·论著·

血小板源性生长因子和血小板源性内皮细胞生长因子在内皮细胞和血管平滑肌细胞中的作用研究

朱晋坤，毛 华，尹扬光，董 文，杜 峰，鲁玉明，熊宗华，邓梦扬

目的 通过体外转染血小板源性生长因子(PDGF)和血小板源性内皮细胞生长因子(PD-ECGF)质粒，观察两种生长因子对人脐静脉内皮细胞EAHY926和主动脉血管平滑肌细胞T/G HA-VSMC的影响，评估两种生长因子对血管损伤治疗的可行性。方法 构建人pcDNA 3.1(+)空载(空载组)、pcDNA 3.1(+)-PDGF-透明质酸(HA) (PPH组) 和pcDNA 3.1(+)-PD-ECGF-HA (PPEH组)质粒，分别转染入EAHY926和T/G HA-VSMC中，四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测内源性PD-ECGF和外源性PD-ECGF对EAHY926和T/G HA-VSMC细胞增殖的影响；细胞伤痕实验观察内源性PD-ECGF和外源性PD-ECGF对EAHY926和T/G HA-VSMC细胞迁移速度的影响。结果 MTT法检测3组EAHY926吸光度值比较，差异有统计学意义(F=235.18，P<0.001)，其中PPH组高于空载组和PPEH组(P<0.05)；空载组与PPEH组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。MTT法检测3组T/G HA-VSMC吸光度值比较，差异有统计学意义(F=82.89，P<0.001)，其中PPH组高于空载组(P<0.05)；PPEH组低于空载组(P<0.05)。MTT法检测转染PPEH质粒的培养基(L-PPEH)对PPH诱导的EAHY926和T/G HA-VSMC增殖的影响，空载组、PPH组、PPH+L-PPEH组EAHY926吸光度值比较，差异无统计学意义(F=512.89,P=0.183)。空载组、PPH组、PPH+L-PPEH组T/G HA-VSMC吸光度值比较，差异有统计学意义(F=317.40,P<0.001)；其中PPH组高于空载组和PPH+L-PPEH组(P<0.05)。细胞伤痕实验证实，转染PPEH质粒的EAHY926、T/G HA-VSMC细胞迁移能力增强；PPEH组EAHY926平均细胞迁移距离百分比(56.1%±2.2%)较空载组(27.8%±3.4%)升高(t=-15.08,P<0.001)；PPEH组T/G HA-VSMC平均细胞迁移距离百分比(69.1%±2.3%)较空载组(43.6%±5.8%)升高(t=-33.64,P<0.001)。用转染PPEH质粒的培养基培养EAHY926、T/G HA-VSMC发现，外源性PD-ECGF处理的EAHY926、T/G HA-VSMC细胞迁移能力亦明显增强。结论 通过转染PDGF质粒，模拟血管损伤后内皮细胞和平滑肌细胞受到PDGF和/或PD-ECGF刺激，发现 PDGF能明显上调内皮细胞和血管平滑肌的增殖和迁移。PD-ECGF对血管内皮细胞增殖的效果不明显，但能上调血管内皮细胞和血管平滑肌的迁移速度；同时PD-ECGF能抑制血管内皮细胞的增殖。两种因子同时使用能抑制平滑肌细胞的过度增殖，促进内皮细胞和平滑肌细胞的迁移。两者联合使用可能成为促进经皮冠状动脉介入术(PCI)后损伤血管恢复及预防血管再狭窄的新策略。

血小板源性生长因子；血小板源性内皮细胞生成因子；血管成形术，气囊，冠状动脉；肌细胞,平滑肌；内皮细胞；细胞增殖

朱晋坤，毛华，尹扬光，等.血小板源性生长因子和血小板源性内皮细胞生长因子在内皮细胞和血管平滑肌细胞中的作用研究[J].中国全科医学，2015，18(9)：1023-1028.[www.chinagp.net]

Zhu JK,Mao H,Yin YG,et al.Role of PDGF and PD-ECGF in endothelial cells and vascular smooth muscle cells[J].Chinese General Practice，2015，18(9)：1023-1028.

经皮冠状动脉介入术(percutaneous coronary intervention，PCI)后靶血管存在血栓形成及血管舒缩功能丧失现象，至今仍是临床应用面临的重大难题。损伤局部血管再内皮化不良是上述过程发生的机制之一。在血管损伤时，血管内皮细胞起着血管修复以及新生血管的作用[1-2]。血小板源性生长因子(PDGF)有助于内皮细胞的增殖[3]，但同时PDGF也能加速平滑肌细胞增殖和迁移[4-5]，这就意味着PDGF很可能导致PCI后靶血管再狭窄。而血小板源性内皮细胞生成因子(PD-ECGF)也被称为胸苷磷酸化酶(TP)，能够加速损伤局部血管内皮生成和迁移，但与PDGF相反的是，PD-ECGF能抑制局部平滑肌细胞过度增殖[6]。PDGF最初是在血小板细胞中发现并由血小板分泌用于创伤修复的生长因子，PDGF是创伤愈合过程中较早出现的生长因子之一,在创面愈合的全过程中起重要作用。在正常情况下，PDGF在血管内皮细胞仅有少量表达，在血管内皮受损如缺血、创伤及炎症等病理条件下，其在血管内皮的表达水平明显升高。本研究基于PDGF和PD-ECGF的特点，在人脐静脉血管内皮细胞EAHY926及主动脉血管平滑肌细胞T/G HA-VSMC内表达PDGF，借以模拟血管损伤后内皮细胞和平滑肌细胞受到PDGF和/或PD-ECGF刺激后两种细胞的增殖迁移变化，旨在研究两者联合用于加速损伤血管重塑、预防PCI后靶血管再狭窄的可行性。

1 材料与方法

1.1 质粒构建 pcDNA 3.1(+)-透明质酸(HA)由第三军医大学公共实验平台留存，本载体在多克隆位点后引入了HA标签(氨基酸序列为：YPYDVPDYA)，可以与目的蛋白融合表达以标记目的蛋白。合成PDGF和PD-ECGF引物。PDGF上游引物:5′-CCGGAATTCATGAATCGCTGCTGGGCGC-3′,下游引物:5′-ACCCAAGCTTGGCTCCAAGGGTCTCCTT-3′；PD-ECGF上游引物:5′-CCGGAATTCATGGCAGCCTTGATGAC-3′，下游引物:5′-ACCCAAGCTTTTGCTGCGGCGGCAGAACG-3′。采用聚合酶链式反应(PCR)从cDNA中富集PDGF和PD-ECGF全长。电泳纯化后采用限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ进行酶切，以表达载体pcDNA 3.1(+)为骨架，重组连接为pcDNA 3.1(+)-PDGF-HA(PPH)和pcDNA 3.1(+)-PD-ECGF-HA(PPEH)质粒。

1.2 细胞培养 EAHY926和T/G HA-VSMC购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，由本实验室冻存。两种细胞均接种于50 ml细胞培养瓶中，在含10%胎牛血清(USA)、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素(hyclone，USA)的RPMI 1640完全培养基中(Life Technology，USA)中，于37 ℃环境中5%二氧化碳(CO2)孵箱中培养。

1.3 质粒转染 按照转染试剂说明书，将2.5 μg (6孔板)或100 ng(96孔板) pcDNA 3.1(+)空载，PPH或PPEH质粒与10 μl(6孔板)或0.5 μl (96孔板)转染试剂(lipofectamin 2000，Life Technology)分别稀释于无血清的240 μl培养基中，5 min后将两种稀释液1∶1混合，20 min后加入事先用无血清和抗生素培养基培养的细胞中，4～6 h后换成RPMI 1640完全培养基继续培养。

1.4 免疫印迹法 收集分别转染了pcDNA 3.1(+)空载(空载组)、PPH(PPH组)或PPEH(PPEH组)质粒72 h后的EAHY926和T/G HA-VSMC的蛋白，用BCA蛋白浓度检测试剂盒和分光光度计测定蛋白浓度，并加入上样缓冲液备用。将总蛋白50 μg于预先配制好的10%或15%聚丙烯酰胺凝胶上样孔中进行分离，每个样本至少用2块平行胶进行分离。通过“三明治”湿法转印于预先活化好的聚偏氟乙烯(PVDF)膜(merck-millipore，USA)上。转印完成后的PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭过夜。一抗孵育2～4 h，磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗涤3次，15 min/次；二抗孵育1～2 h，PBST洗涤3次，15 min/次，其后显色观察。

1.5 四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法) 细胞接种在96孔板中，每孔6 000个细胞，在培养基中培养约24 h后转染PPH或PPEH质粒；每组4个重复孔；继续培养，72 h后，5 mg/ml MTT溶液加入到各孔中，100 μl/孔，于37 ℃温育2～4 h，除去MTT后每孔

本研究创新点：

损伤血管再内皮化及重塑是经皮冠状动脉介入术(PCI)预后的关键。既往研究证实血小板源性生长因子(PDGF)只在损伤血管的内皮细胞中高表达，以促进平滑肌细胞和内皮细胞的迁移和增殖，但平滑肌细胞的过度增殖常引起血管的再狭窄，影响PCI效果。同时，有研究表明，正常情况下，血小板源性内皮细胞生长因子(PD-ECGF)可能抑制平滑肌细胞的增殖，但促进平滑肌细胞和内皮细胞的迁移。但对PD-ECGF在血管损伤、PDGF高表达的情况下，是否能拮抗PDGF的促增殖效果，抑制平滑肌细胞增殖，目前为止并没有明确的报道。本研究提出假设，认为在损伤血管细胞中，高表达PDGF的内皮细胞或平滑肌细胞的增殖和迁移可能受到外源性PD-ECGF的影响，且PD-ECGF和PDGF的联合使用在促进血管内皮细胞迁移增殖/加速血管重塑的同时也可抑制平滑肌细胞过度增殖。本研究通过高表达PDGF模拟血管损伤状态下的内皮细胞和平滑肌细胞，证实其促进了平滑肌和内皮细胞的迁移和增殖；在此基础上，发现PD-ECGF可以抑制PDGF引起的平滑肌细胞增殖，但不影响PDGF引起的内皮细胞增殖，且进一步促进平滑肌细胞及内皮细胞的迁移。研究结果为改善PCI预后、加速损伤血管重塑、防止血管再狭窄提供了潜在的干预靶标。

加入100 μl二甲基亚砜(DMSO)，摇床上缓慢摇动30 min。在酶标仪中490 nm处读取吸光度值。

1.6 细胞伤痕实验 用标记笔在6孔板底部均匀划上3～4条横线，将适量EAHY926或T/G HA-VSMC种植于6孔板内〔(1～2)×105个/孔〕，贴壁转染24 h或未转染48 h后用蓝色无菌1 ml枪尖在6孔板内伤痕；PBS清洗，除去漂浮细胞后，加入低浓度血清培养基(含2% FBS的培养基)。以横线为参照物，取3个点的平均值，细胞迁移距离百分比=(0 h时细胞平均间距-24 h后细胞平均间距)/0 h时细胞平均间距。

2 结果

2.1 PPH和PPEH对EAHY926增殖的影响 3组EAHY926吸光度值比较，差异有统计学意义(F=235.18，P<0.001)；其中PPH组高于空载组和PPEH组，差异有统计学意义(P<0.05)；空载组与PPEH组比较，差异无统计学意义(P>0.05，见图1)。

注：PPH=pcDNA 3.1(+)-血小板源性生长因子-透明质酸，PPEH=pcDNA 3.1(+)-血小板源性内皮细胞生长因子-透明质酸；与PPH组比较，*P<0.05

图1 MTT法检测3组EAHY926吸光度值

Figure 1 Absorbance values of EAHY926 among three groups detected by MTT method

2.2 PPH和PPEH对T/G HA-VSMC增殖的影响 3组T/G HA-VSMC吸光度值比较，差异有统计学意义(F=82.89，P<0.001)；其中PPH组高于空载组，差异有统计学意义(P<0.05)；PPEH组低于空载组，差异有统计学意义(P<0.05，见图2)。

注：与空载组比较，*P<0.05

图2 MTT法检测3组T/G HA-VSMC吸光度值

Figure 2 Absorbance values of T/G HA-VSMC among three groups detected by MTT method

2.3 外源性PD-ECGF对EAHY926和T/G HA-VSMC增殖的影响 MTT法检测转染PPEH质粒的培养基(L-PPEH)对PPH诱导的EAHY926和T/G HA-VSMC增殖的影响，空载组、PPH组、PPH+L-PPEH组EAHY926吸光度值比较，差异无统计学意义(F=512.89,P=0.183)。空载组、PPH组、PPH+L-PPEH组T/G HA-VSMC吸光度值比较，差异有统计学意义(F=317.40,P<0.001)；其中PPH组高于空载组和PPH+L-PPEH组，差异有统计学意义(P<0.05，见图3)。

2.4 PD-ECGF对EAHY926迁移的影响 细胞伤痕实验证实，转染PPEH质粒的EAHY926细胞迁移能力增强(见图4A)；PPEH组EAHY926平均细胞迁移距离百分比(56.1%±2.2%)较空载组(27.8%±3.4%)升高，差异有统计学意义(t=-15.08,P<0.001)。

用转染PPEH质粒的培养基培养转染PPH质粒的EAHY926，发现外源性PD-ECGF转染PPEH质粒后EAHY926细胞迁移能力亦明显增强(见图4B)。

注：A为EAHY926，B为T/G HA-VSMC；与PPH组比较，*P<0.05

图3 MTT法检测转染PPEH质粒的培养基对PPH诱导的EAHY926和T/G HA-VSMC增殖的影响

Figure 3 MTT method detecting the influence of medium transfected with PPEH on the proliferation of EAHY926 and T/G HA-VSMC induced by PPH

图4 PD-ECGF对EAHY926细胞迁移能力的影响

2.5 PD-ECGF对T/G HA-VSMC迁移的影响 细胞伤痕实验证实，转染PPEH质粒的T/G HA-VSMC细胞迁移能力增强(见图5A)；PPEH组T/G HA-VSMC平均细胞迁移距离百分比(69.1%±2.3%)较空载组(43.6%±5.8%)升高，差异有统计学意义(t=-33.64,P<0.001)。

用转染PPEH质粒的培养基培养转染PPH质粒的HA-VSMC，发现T/G HA-VSMC细胞迁移能力亦明显增强(见图5B)。

图5 PD-ECGF对T/G HA-VSMC细胞迁移能力的影响

Figure 5 Influence of PD-ECGF on the migration of T/G HA-VSMC

3 讨论

PDGF最初在血清和血小板中发现，能在体外诱导平滑肌细胞和成纤维细胞的分裂，因此被认为是一种分裂素[7-8]，而且在促进细胞增殖、迁移以及血管外周细胞重建中起着重要作用[9]。本研究发现，PDGF能明显诱导血管内皮细胞和平滑肌细胞的增殖，这与既往研究结果[10]一致。内皮细胞和平滑肌细胞的迁移和增殖是血管受损后的正常生理反应，目的是修复损伤的血管，PDGF在其中起到关键作用。但PDGF可以引起平滑肌细胞过度增殖，后者被认为在血管再狭窄过程中扮演重要角色[11]。正常血管内皮细胞几乎不表达或者很少表达PDGF，而损伤的血管内皮细胞则高表达PDGF。于是本研究通过高表达PDGF来模拟受损的内皮细胞，同时采用由内皮细胞表达的PD-ECGF来培养内皮细胞和血管平滑肌细胞，外源PD-ECGF培养高表达PDGF的内皮细胞和平滑肌细胞，观察两种细胞的增殖迁移情况。PD-ECGF能明显抑制平滑肌细胞增殖，诱导内皮细胞迁移，是理想的抑制平滑肌细胞过度增殖的细胞因子[12-13]。本研究结果还发现，在PDGF过表达的环境中内皮细胞和平滑肌细胞的增殖虽然明显上调，但PD-ECGF却能拮抗并抑制平滑肌细胞的增殖，而对PDGF过表达引起的内皮细胞增殖并无明显抑制。PD-ECGF能诱导内皮细胞增殖[14]，但是在与PDGF合用时却没有表现出拮抗作用，引起该结果的原因可能是内皮细胞增殖的速度已经趋于饱和。由上述结果，本研究假设PDGF可增殖血管内皮细胞和平滑肌细胞，而PD-ECGF却能抑制平滑肌细胞的过度增殖，两者在血管重铸的过程中共同作用加速伤口愈合防止血管狭窄。

PD-ECGF/TP是嘧啶核苷合成和分解过程中的一个重要酶,主要分布于血小板、淋巴细胞、网状细胞核胎盘基质中，其一个重要产物磷酸脱氧核糖(dRP)是血管生成和血管内皮细胞增殖迁移的必须因子。同时，PD-ECGF在体内血管生成中起着重要作用，能趋化内皮细胞，抑制低氧环境下的细胞凋亡[15]。近年来，PD-ECGF作为血管内皮生长因子在血管重塑和血管生成中受到了广泛关注。国内外一些实验室证实，PD-ECGF能诱导肿瘤细胞模型中血管内皮细胞的迁移却不增强肿瘤的侵袭[16]。而最近关于PD-ECGF与血管平滑肌细胞的文章则认为，PD-ECGF通过激活STAT3来抑制平滑肌细胞的增殖[17]。本研究结果则显示，PDGF和PD-ECGF均能增强内皮细胞和平滑肌细胞的迁移。内源性PD-ECGF可以明显促进内皮细胞和平滑肌细胞的迁移；外源性PD-ECGF可以进一步促进PDGF过表达状态下内皮细胞和平滑肌细胞的迁移，但却能抑制过表达PDGF状态下平滑肌细胞的增殖。两者联合在加速内皮细胞增殖的同时，在抑制平滑肌细胞过度增殖上起重要作用。两种生长因子在损伤内皮细胞和平滑肌细胞的定位功能上也可能有相互联系，后续的具体机制还需进一步在体内进行研究或验证。

总之，本研究提示，利用PDGF对内皮细胞和平滑肌细胞的增殖作用，诱导两种细胞增殖并迁移至受损处，同时利用PD-ECGF抑制平滑肌细胞过度增殖、趋化内皮细胞的特点，将有助于PCI后损伤血管的修复，降低PCI后血管再狭窄风险，具有潜在的临床应用价值。

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(本文编辑：陈素芳)

Role of PDGF and PD-ECGF in Endothelial Cells and Vascular Smooth Muscle Cells

ZHUJin-kun,MAOHua,YINYang-guang,etal.

DepartmentofVasculocardiology,theFirstPeople′sHospitalofGuiyang,Guiyang550002,China

Objective To investigate the influence of platelet derived growth factor (PDGF) and platelet-derived endothelial cell growth factor (PD-ECGF) on human umbilical endothelial cells EAHY926 and human-aorta vascular smooth muscle cells T/G HA-VSMC by transfecting the plasmids of PDGF and PD-ECGF in vitro and to evaluate the possibility of treating vascular injury by the two kinds of plasmids.Methods pcDNA 3.1(+)no-load (no-load group)，pcDNA 3.1(+)-PDGF-HA (PPH group) and pcDNA 3.1 (+)-PD-ECGF-HA (PPEH group) plasmids were constructed and transfected into EAHY926 and T/G HA-VSMC.MTT method was used to evaluate the influence of endogenous and exogenous PD-ECGF on the proliferation of EAHY926 and T/G HA-VSMC before and after transfection.Cell wound healing assay was used to evaluate the influence of endogenous and exogenous PD-ECGF on the migration speed of EAHY926 and T/G HA-VSMC after transfection.Results MTT method was used to detect the absorbance value of EAHY926 among the three groups,and the differences were statistically significant (F=235.18,P<0.001),with the PPH group significantly higher than the no-load group and PPEH group (P<0.05).The no-load group and PPEH group showed no statistically significant differences (P>0.05).MTT method was also used to detect the absorbance value of T/G HA-VSMC among the three groups,and the differences were statistically significant (F=82.89,P<0.001),with the PPH group significantly higher than the no-load group(P<0.05),and the PPEH group significantly lower than the no-load group(P<0.05).MTT method detecting the influence of medium transfected with PPEH on the proliferation of EAHY926 and T/G HA-VSMC induced by PPH.There was no significant difference in the absorbance value of EAHY926 among no-load group，PPH group and PPH+L-PPEH group(F=512.89,P=0.183).There was significant difference in the absorbance value of T/G HA-VSMC among no-load group,PPH group and PPH+L-PPEH group (F=317.40,P<0.001),with the PPH group significantly higher than the no-load group and PPH+L-PPEH group(P<0.05).Cell wound healing assay demonstrated that EAHY926 and T/G HA-VSMC transfected with PPEH plasmid had a higher migration ability;compared with the no-load group,the average percentage of cell migration distance of EAHY926 in PPEH group was significantly increased〔(56.1%±2.2%) vs.(27.8%±3.4%)〕 (t=-15.08,P<0.001);compared with the no-load group,the average percentage of cell migration distance of T/G HA-VSMC in PPEH group was significantly increased〔(69.1%±2.3%) vs.(43.6%±5.8%)〕(t=-33.64,P<0.001).EAHY926 and T/G HA-VSMC cultured in medium transfected with PPEH showed that the migration ability of EAHY926 and T/G HA-VSMC transfected with PPEH processed by exogenous PD-ECGF also increased significantly.Conclusion After transfection of PDGF plasmid,the stimulation of PDGF and/or PD-ECGF on endothelial cells and smooth muscle cells is simulated.It is found that PDGF can significantly up-regulate the proliferation and migration of endothelial cells and smooth muscle cells.PD-ECGF has limited influence on the proliferation of vascular endothelial cells,but can up-regulate the migration speed of vascular endothelial cells and vascular smooth muscle cells.Meanwhile,PD-ECGF can inhibit the proliferation of vascular endothelial cells.The combined application of the two factors can inhibit over-proliferation of smooth muscle cells and promote migration of endothelial cells and smooth muscle cells.The combination may become a new strategy for the recovery of vascular damage and prevention of vascular restenosis after PCI.

Platelet-derived growth factor；Platelet-derived endothelial cell growth factor；Angioplasty,balloon,coronary；Myocytes,smooth muscle；Endothelial cells；Cell proliferation

贵州省科技厅社会发展项目(黔科合SY[2010]3087号)

550002贵州省贵阳市第一人民医院心血管内科(朱晋坤，毛华，董文，杜峰，鲁玉明，熊宗华)；第三军医大学附属新桥医院心血管内科(尹扬光，邓梦扬)

朱晋坤，550002贵州省贵阳市第一人民医院心血管内科；E-mail：jkz2001@163.com

R 349.51

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.09.010

2014-07-21；

2015-01-02)