重组人红细胞生成素对癫痫持续状态大鼠海马线粒体凋亡途径相关调控因子的影响及作用机制

史志勤，卞红磊，魏艳静，尹晓琳，张 荣，梁文杰，刘瑞春，王维平，于江华



·论著·

重组人红细胞生成素对癫痫持续状态大鼠海马线粒体凋亡途径相关调控因子的影响及作用机制

史志勤，卞红磊，魏艳静，尹晓琳，张 荣，梁文杰，刘瑞春，王维平，于江华

目的 观察重组人红细胞生成素(rHuEPO)对戊四氮(PTZ)点燃的癫痫持续状态(SE)的成年雄性(SD)大鼠海马神经元磷酸化蛋白激酶B(p-PKB/p-Akt)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和X-连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)表达的影响，并进一步探讨rHuEPO作用的可能机制。方法 于2010年3月，由河北省实验动物中心提供的健康清洁级成年SD大鼠。采用PTZ点燃大鼠SE模型，将大鼠随机分为B组(PTZ+0.9%氯化钠溶液)、C组(PTZ+rHuEPO)、D组(PTZ+LY294002+rHuEPO)、E组(PTZ+二甲基亚砜+rHuEPO)，同时另选取不进行SE制模的SD大鼠作为A组(0.9%氯化钠溶液)，检测大鼠行为学和脑电图的改变；用原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测海马神经元的凋亡情况；免疫组织化学法观察p-Akt、Bax、XIAP的阳性细胞数；反转录多聚酶链反应(RT-PCR)方法检测各组大鼠海马Bax信使RNA(BaxmRNA)的表达；Western blot方法检测各组大鼠海马蛋白激酶B(Akt)、p-Akt、XIAP蛋白的表达。结果 与B组比较，C组p-Akt、XIAP阳性细胞数和p-Akt、XIAP蛋白表达水平均增多，Bax阳性细胞数及BaxmRNA表达水平均减少，差异有统计学意义(P<0.05)；与C组比较，D组p-Akt、XIAP阳性细胞数和p-Akt、XIAP蛋白表达水平均减少，Bax阳性细胞数及BaxmRNA表达水平均增多，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 rHuEPO可以提高p-Akt、XIAP阳性细胞数及蛋白表达水平，降低Bax阳性细胞数及BaxmRNA表达水平，减少海马神经元的凋亡，发挥神经保护作用；加入磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂LY294002后，海马p-Akt、XIAP阳性细胞数及蛋白表达减少、Bax阳性细胞数及BaxmRNA表达增加，海马神经元的凋亡增加，减弱了rHuEPO的保护作用。因此，PI3K/Akt信号通路是rHuEPO发挥神经保护作用的通路之一，其作用机制可能是rHuEPO活化PI3K/Akt后，提高p-Akt蛋白及线粒体凋亡途径相关调控因子XIAP的表达，下调了Bax的表达，从而介导线粒体凋亡途经，发挥抗凋亡、促存活的神经保护作用。

癫痫持续状态；重组人红细胞生成素；磷酸肌醇3-激酶类；蛋白激酶类；Bcl-2相关X蛋白质；X连锁凋亡抑制蛋白质

史志勤，卞红磊，魏艳静，等.重组人红细胞生成素对癫痫持续状态大鼠海马线粒体凋亡途径相关调控因子的影响及作用机制[J].中国全科医学，2015，18(19)：2310-2316.[www.chinagp.net]

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Kondratyev等[1]、Covolan等[2]研究证实，坏死和凋亡是癫痫所致神经元死亡的两种主要形式。大量的动物实验已经揭示，线粒体依赖途径、内质网依赖途径、死亡受体依赖途径是凋亡发生时的重要路径,其中较为主要的是线粒体依赖途径。Bcl-2家族蛋白、Caspase家族蛋白、凋亡抑制蛋白家族(IAPs)都是重要的线粒体依赖凋亡途径的相关调控因子。促凋亡成员Bcl-2相关X蛋白(Bax)、Bad等，和抗凋亡成员Bcl-2、Bcl-xl等都是Bcl-2蛋白家族中非常重要的成员。IAPs家族包括X-连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibtor of apoptosis protein,XIAP)、Survivin、Hiap-1、Livin等。近些年在中枢神经系统的研究中，促红细胞生成素(EPO)的保护机制正在逐渐被挖掘，已得到充分肯定的是它的抗凋亡功能。但EPO在癫痫中是怎样发挥保护作用的知之甚少，因此本研究使用戊四氮(pentylenetetrazol,PTZ)点燃成年雄性(Sprague-Dawley,SD)大鼠癫痫持续状态(status epilepticus，SE)模型用以研究重组人红细胞生成素(recombinant human EPO，rHuEPO)的抗凋亡作用，并通过抑制磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidyl inositol 3 kinase，PI3K)/ 蛋白激酶B(Akt)途径探讨rHuEPO可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 于2010年3月，由河北省实验动物中心提供的健康清洁级成年SD大鼠。实验起始体质量为(220±20)g，环境温度为22～25 ℃，12 h光亮/黑暗条件，各组动物混合饲养。

1.2 主要实验试剂及器材 PTZ、LY294002(美国Sigma公司)；rHuEPO(济脉欣华北制药金坦生物技术股份有限公司)；原位细胞凋亡检测试剂盒(美国ROCHE公司)；二甲基亚砜(DMSO)、兔抗Akt多克隆抗体、兔抗p-Akt(Thr-308)多克隆抗体、兔抗Bax多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；兔抗XIAP多克隆抗体(英国Abcam公司)；BCA蛋白定量试剂盒(Novagen公司)；TRIzol试剂(Invitrogen公司)；反转录多聚酶链反应(RT-PCR)反转录及扩增试剂(Promega公司)，引物(上海生工生物技术有限公司)。病理图像分析仪系统(Olympus显微镜，病理图像分析软件由北京航空航天大学图像中心制造)；脑电图机(日本Neu-rofax 7314F)；立体定向仪(日本Narishige SR-6N)；PCR仪(Eppendorf)；Western blot远红外荧光扫描成像系统(Odyssey)；凝胶扫描分析系统(Syngene公司)。

1.3 方法

1.3.1 SE模型制备及实验分组 健康成年SD大鼠228只，参照文献[3]的方法建立动物模型：PTZ 20 mg/kg大鼠腹腔注射，然后每10 min注射10 mg/kg，直至达到足够强度和SE。大鼠惊厥的行为表现采用Racine 6级评价标准，Ⅳ、Ⅴ级发作即为全身性惊厥大发作，持续30 min及以上者为SE。制模过程中因长时间持续的强直惊厥而死亡或不符合模型要求的大鼠，予以剔除并随机补充。筛选补充后获得合格动物140只，随机分为4组：B组(PTZ+0.9%氯化钠溶液)、C组(PTZ+rHuEPO)、D组(PTZ+LY294002+rHuEPO)、E组(PTZ+DMSO+rHuEPO)，每组动物35只。同时另选取35只不进行SE制模的健康成年SD大鼠作为A组(0.9%氯化钠溶液)。

1.3.2 给药情况 B组：腹腔注射PTZ点燃SE发作后30 min腹腔注射0.9%氯化钠溶液；C组：腹腔注射PTZ点燃SE发作后30 min腹腔注射rHuEPO 5 000 U/kg[4]；D组：LY294002溶于DMSO中，浓度为10 μg/5 μl,给药体积5 μl，腹腔注射PTZ点燃SE发作后10 min脑室注射给予5 μl LY294002，SE发作后30 min腹腔注射rHuEPO 5 000 U/kg；E组：腹腔注射PTZ点燃SE发作后10 min脑室注射给予5 μl DMSO，SE发作后30 min腹腔注射rHuEPO 5 000 U/kg；A组：腹腔注射相同体积、次数的0.9%氯化钠溶液。

1.3.3 大鼠侧脑室立体定位及注射给药 根据George Paxions的图谱定位，即坐标为矢状缝旁开1.5 mm，硬脑膜下3.8 mm，前囟后0.8 mm。PTZ点燃SE发作后10 min，E组注射5 μl DMSO，D组注射LY294002 5 μl,注射完毕后均留针5 min,拔针缓慢，而后观察动物行为学表现。

1.3.4 大鼠行为学观察及脑电图(EEG)描记

1.3.4.1 大鼠癫痫发作情况 于腹腔注射药物后观察2 h，记录各组大鼠癫痫发作情况。

1.3.4.2 EEG描记 每组大鼠选取5只进行EEG描记。用10%水合氯醛35 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，然后固定于立体定位仪上，暴露颅骨。采取左右皮质，左右海马4个电极建立8个导联。皮质电极：前囟中点向前2 mm，中线旁开2 mm，深2 mm；海马电极：前囟中点向后3.8 mm，中线旁开2.4 mm，深3.8 mm。牙钻钻孔，插入电极，用立体定位仪上的电极夹固定，鼻尖为参考电极。设定纸速30 mm/s,灵敏度20 μV/mm，时间常数0.1，滤波15 Hz。待大鼠清醒后开始根据不同的分组进行相应的EEG描记。

1.3.5 海马组织学观察

1.3.5.1 标本制作 每组大鼠选取10只进行标本制作。大鼠在SE后24 h用10%水合氯醛麻醉，开胸后主动脉插管,连接自制灌注系统，将右心耳剪开后，作为灌注液的流出口。用0.9%氯化钠溶液约500 ml和4%多聚甲醛500 ml先后灌流固定，开颅后取出脑组织，在乳头体与视交叉处分别垂直横断脑组织，把含有海马的中段脑组织(含脑室注射部位在内)放置于4%多聚甲醛溶液中，4 ℃ 24 h。常规脱水、透明、石蜡包埋。冠状位连续切片,直至切出海马组织，每片的厚度约为5 μm，分别进行原位末端转移酶标记技术(TUNEL)染色和免疫组化染色。

1.3.5.2 海马组织病理学观察 (1)TUNEL染色：使用原位凋亡检测试剂盒进行测定，将海马区凋亡细胞进行计数。每一标本取3张切片，每张切片在海马区取10个位置不同的视野，将3张切片的平均值作为该标本的结果，将该组10例样本均值作为该组的实验结果。(2)免疫组化染色：采用过氧化物酶标记的链霉卵白素(SP)法。在切片中分别加p-Akt(Thr-308)、Bax、XIAP等一抗，4 ℃过夜，然后依次加入生物素标记的二抗、辣根过氧化酶标记的链霉卵白素工作液，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精复染。用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。检测海马区神经元p-Akt、Bax、XIAP蛋白表达。每一标本取3张切片,每张切片在海马区随机取10个位置不重复的视野，分别计数染色阳性细胞数(以断面上有细胞核者为准)，取3张切片的均值作为该标本结果，以该组10例样本均值作为该组实验结果。

1.3.6 RT-PCR检测 每组大鼠各取10只，迅速分离海马，TRIzol提取海马总RNA，测定其浓度及纯度。每个样品取2 μg RNA反转录合成cDNA，再各取1 μl cDNA进行PCR扩增。引物序列，Bax上游：5′-CATCTCCTTCATCCTTGCTG-3′，下游：5′-CCAGCCACAAAGATGGTCACT-3′，扩增长度为500 bp；β-actin上游：5′-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3′,下游:5′-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3′，扩增长度为375 bp。引物由上海生工生物工程技术公司合成。PCR反应条件为：Bax 95 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，59 ℃退火45 s，72 ℃ 延伸1 min，循环30次，最后72 ℃延伸10 min。取RT-PCR产物5 μl行琼脂糖凝胶电泳，UVP凝胶成像系统扫描定量电泳条带的灰度，以Bax/β-actin表示产物的相对含量，凝胶图像分析系统分析结果。半定量结果重复分析5次，取平均值进行统计分析。

1.3.7 Western blot检测 每组大鼠各取10只，迅速剥离海马，提取总蛋白。BCA法测定蛋白浓度。取50 μg蛋白95～98 ℃变性5 min，以非连续的Tris-SDS聚丙烯酰凝胶垂直平板电泳电转印到硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入多克隆兔抗Akt、p-Akt抗体(1∶300，封闭液稀释)，多克隆兔抗XIAP抗体(1∶200，封闭液稀释)，4 ℃孵育过夜。四聚丙烯(烷基)苯磺酸盐(TPBS)漂洗5次×5 min，加入羊抗兔IgG荧光抗体(1∶3 000)室温孵育1 h，TPBS漂洗4次×10 min，PBS漂洗1次×10 min，荧光扫描成像系统扫描并测定目标带单位密度，与β-actin(1∶800)单位密度值相比后行统计分析。结果重复分析5次，取平均值进行统计分析。

2 结果

2.1 大鼠癫痫发作情况 接受PTZ注射的大鼠共228只，86只应用30 mg/kg、88只应用40 mg/kg、54只应用50 mg/kg即开始出现惊厥，主要表现为肌阵挛。大鼠SE持续时间大约为30 min以上。制模过程中84只因长时间持续的强直惊厥而死亡，死亡率为31.9%，4只不符合模型要求，均予以剔除并随机补充。

2.2 EEG变化情况 A组大鼠脑电图以α、β波为主，散在θ波，无异常放电表现；B组大鼠阵发出现大量高幅尖波、棘波、棘慢复合波、尖慢复合波；C、D、E组大鼠痫性放电明显受到抑制，棘波、尖波、棘-慢复合波、尖-慢复合波等痫性发作减少或波幅降低；C、E组较D组癫痫样放电明显减少。

2.3 TUNEL染色结果 光镜下胞核呈棕黄色表现者为TUNEL染色阳性细胞，即凋亡细胞。A组可以见到少量的凋亡细胞出现，其余4组海马区亦均有不同程度的凋亡细胞分布。其中B、C、D、E组凋亡细胞数与A组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；C、D、E组凋亡细胞数与B组比较，差异亦有统计学意义(P<0.05)；D组凋亡细胞数与C组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，而E组凋亡细胞数与C组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；E组凋亡细胞数与D组比较，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.4 免疫组化染色结果 海马区p-Akt、Bax、XIAP蛋白的表达，即阳性细胞为有棕黄色着色的神经元，除了胞核和胞膜有少量阳性信号外，阳性信号主要位于胞质中(见图1、2)。A组神经元核膜周围的胞质中，偶然可以见到棕黄色散在颗粒分布；其中B、C、D、E组p-Akt、Bax、XIAP阳性细胞数与A组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，并且有阳性信号也开始出现在胞核中；C、D、E组p-Akt、Bax、XIAP阳性细胞数与B组比较，差异亦有统计学意义(P<0.05)；D组p-Akt、Bax、XIAP阳性细胞数与C组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，而E组p-Akt、Bax、XIAP阳性细胞数与C组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；E组p-Akt、Bax、XIAP阳性细胞数与D组比较，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

Table 1 Comparison of the number of cells with positive p-Akt,Bax and XIAP and the number of apoptotic cells in the hippocampal area among the five groups

组别只数凋亡细胞p-AktBaxXIAPA组10723±1052141±1201932±1601394±151B组102672±353a2657±246a3654±175a1887±265aC组101659±112ab5481±508ab2391±076ab3473±392abD组102108±267abc3307±487abc2932±166abc2517±202abcE组101747±186abd5235±463abd2419±076abd3129±279abdF值1919587822562950P值<001<005<005<005

注：与A组比较，aP<0.05；与B组比较，bP<0.05；与C组比较，cP<0.05；与D组比较，dP<0.05；p-Akt=磷酸化蛋白激酶B；Bax=Bcl-2相关X蛋白，XIAP=X-连锁凋亡抑制蛋白

注：A、B、C、D、E分别为A、B、C、D、E组

图1 5组大鼠海马区Bax阳性细胞表达情况(SP×400)

Figure 1 Expression of the cells with positive Bax in the hippocampal area of the five groups

图2 5组大鼠海马区XIAP阳性细胞表达(SP×400)

2.5 RT-PCR测定结果 大鼠海马Bax信使RNA(BaxmRNA)表达情况，A组BaxmRNA有微弱表达；B、C、D、E组BaxmRNA表达水平与A组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；C、D、E组BaxmRNA表达水平与B组比较，差异亦有统计学意义(P<0.05)；D组BaxmRNA表达水平与C组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，而E组BaxmRNA表达水平与C组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；E组BaxmRNA表达水平与D组比较差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

2.6 Western blot结果 采用Western blot检测大鼠海马组织p-Akt、Akt及XIAP蛋白表达情况。结果显示，B、C、D、E组p-Akt、XIAP蛋白表达水平与A组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；C、D、E组p-Akt、XIAP蛋白表达水平与B组比较，差异亦有统计学意义(P<0.05)；D组p-Akt、XIAP蛋白表达水平与C组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，而E组p-Akt、XIAP蛋白表达水平与C组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；E组p-Akt、XIAP蛋白表达水平与D组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。5组Akt蛋白表达水平间差异无统计学意义(P>0.05，见表2)。

Table 2 Comparison of expression levels of BaxmRNA,p-Akt,Akt and XIAP in the hippocampal area among the five groups

组别只数BaxmRNAp-Akt/β-actinAkt/β-actinXIAP/β-actinA组10035±006040±006104±005036±005B组10088±003a053±004a098±006047±004aC组10050±003ab077±003ab102±005074±003abD组10065±005abc064±001abc100±004058±003abcE组10051±002abd076±003abd101±001071±003abdF值175315700021835P值<001<005>005<005

注：与A组比较，aP<0.05；与B组比较，bP<0.05；与C组比较，cP<0.05；与D组比较，dP<0.05；BaxmRNA=Bax信使RNA，Akt=蛋白激酶B

3 讨论

PTZ是中枢神经系统兴奋剂中的一种，无神经毒性等副作用，引起的行为及神经病理的改变与人类极为相似[5]，本实验制作的SE模型也采用PTZ点燃的方法，实验结果所呈现出的成功率和发作形式与国外的报道基本相同[6]。

EPO根本无法透过血-脑脊液屏障(BBB)是以前一些研究者的观点，他们认为EPO是一种巨大的糖蛋白，在中枢神经系统中很难产生效果[7]。但是现在的许多实验结果证实，EPO是可以透过BBB的，它是通过一种特殊的可饱和转运机制来实现此功能[8-9]。EPO和它的特异性受体在神经元、内皮细胞和神经胶质细胞均有一定数量的表达。EPO是否能通过BBB也是本实验在设计之初重点考虑的问题之一。

有许多实验结果显示，EPO是通过对PI3K和酪氨酸激酶2(jauns kinase 2,Jak 2)的激活来引发Akt的磷酸化,当PI3K的85 kd的调节亚单位与EPO受体结合后，110 kd的催化亚单位激活,引起Akt的磷酸化。激活后的Akt通过对底物中的丝氨酸、苏氨酸残基磷酸化的调节来实现它的抗凋亡的神经保护作用[10]。近年来发现PI3K/Akt通路是一条经典的通路，PI3K和Akt是该通路的中心环节。该通路在细胞的转录、凋亡、分化、血管形成等方面起着重要作用。PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，其产物可直接或间接激活Akt，PI3K途径通过激活Akt来实现抵抗凋亡、促进神经元存活的作用。凋亡蛋白Caspase-9Ser196和BadSer136是被Akt磷酸化的多种分子中的较为重要的成员,Akt主要也是通过此机制对它们诱导凋亡的作用来进行调控，从而发挥作用[11]。对PI3K进行标准的量化测量是有一定难度的，因此许多研究，通过构建PI3K某些亚基缺失、基因敲除的动物模型或者其抑制剂LY294002和wortmannin来观察PI3K的效能。虽然LY294002和wortmannin都是靶向PI3K的催化亚基p110的选择性、高竞争性抑制剂，LY294002比wortmannin更加稳定，可信度更高[12]。所以本研究中也将LY294002应用其中，这样就能进一步验证rHuEPO是否通过PI3K/Akt途径实现抵抗神经元凋亡的保护作用。

EPO在缺血低氧性脑损伤[13]、脊髓损伤[14]、闭合性脑创伤[15]等不同的体内外神经损伤模型中都具有抗神经元凋亡的作用，但在PTZ点燃的大鼠SE中是否有抗凋亡作用，以及是否通过了较为主要的PI3K/Akt通路还知之甚少，鉴于此，本研究建立PTZ点燃SE大鼠模型，观察大鼠海马区神经元的凋亡和p-Akt表达的变化及rHuEPO的影响，以及应用PI3K抑制剂LY294002，用以观察rHuEPO是否通过PI3K/Akt途径发挥抗凋亡的神经保护作用。

本研究结果显示，PTZ致SE大鼠EEG中，呈现出癫痫样放电的表现。海马神经元凋亡阳性细胞的出现，使海马神经元内p-Akt的表达升高；使用rHuEPO可明显降低癫痫样放电的发生、减少神经元凋亡阳性细胞的数量、p-Akt在海马神经元内的表达也被明显提升，充分显示了rHuEPO抵抗凋亡的效用。rHuEPO使用前给予LY294002对PI3K进行干预，p-Akt的表达呈现减少的状态，海马神经元的凋亡阳性细胞增加，更加有力地说明rHuEPO能够激活重要的PI3K/Akt路径，这与Akt的活性被其提高密切相关，从而发挥抵抗凋亡，促进神经元存活的保护作用。与Kilic等[16]在局灶性脑缺血的研究中所呈现的结果相一致。

Bax大多数存在于胞质中，当凋亡信号传达到细胞后,Bax的N末端在结构上发生突变现象，这样使得它无法定位于线粒体外膜,从而失去其凋亡调控功能。Bax从胞质转位到线粒体膜上从而启动了线粒体介导的凋亡路径[17]。在哺乳动物身上被克隆出来的IAPs家族成员中，XIAP是最早被发现的，抗凋亡能力最强的成员之一[18-19]。Dan等[20]研究发现，Akt可以磷酸化XIAP的Ser87位点，Akt磷酸化XIAP后，一方面可以保护XIAP不被泛素化和降解，另一方面XIAP的自动泛素化也可以被Akt抑制，这样就能增强XIAP的稳定性和它的细胞内水平，从而达到帮助细胞生存，抵制凋亡发生的功效。在线粒体凋亡途径中,IAPs有3种方式来实现抑制凋亡的作用，分别为：直接与pro-Caspase-9作用干扰其加工过程；IAPs的CARD区与Apaf-1竞争性结合，阻断Caspase活化；直接抑制活化的Caspase[21]，通过以上方式来调节Bax/细胞色素C介导的线粒体凋亡途径[22-23]。因此Bax、XIAP都是线粒体凋亡途径的重要相关调控因子。所以，本研究把Bax、XIAP作为重要的观察指标，借以来了解大鼠海马Bax及XIAP表达的变化以及rHuEPO对它们的影响，更深入地去研究rHuEPO对线粒体相关调控因子Bax和XIAP进行调控所显现的抵抗神经元凋亡的作用是否通过了PI3K/Akt途径。本研究发现，在PTZ点燃SE后激活了海马神经元中促凋亡蛋白Bax、BaxmRNA的表达以及抗凋亡蛋白XIAP的表达，给予rHuEPO干预后，Bax及BaxmRNA的表达下降，XIAP蛋白的表达增加。提示rHuEPO对Bax以及XIAP的表达有一定的调控作用。

因为 EPO 也能够通过其他的信号路径来实现其功能，因此该实验应用PI3K抑制剂LY294002更深入地去研究rHuEPO对Bax和XIAP进行调控所显现的抵抗神经元凋亡的作用是否通过了PI3K/Akt途径。实验结果为加入LY294002后，海马神经元内Bax及BaxmRNA的表达明显增加，XIAP蛋白的表达明显下降。这些都更有力地验证了rHuEPO通过PI3K/Akt途径对线粒体凋亡途经的相关调控因子进行调控，进而介导线粒体凋亡途经，发挥抗凋亡的神经保护作用。rHuEPO对Bax和XIAP进行调控所显现的抵抗神经元凋亡的作用通过了PI3K/Akt途径，介入到线粒体凋亡途径中来才得以实现的。

而且，在本实验结果中也发现B组与D组进行比较也有统计学差异，揭示rHuEPO在给予LY294002干预后，仍有部分保护作用，这其中的机制也许是EPO通过PI3K/Akt途径之外的其他途径，如JAK/ STAT[24]信号途径、NF-κB[25]途径、PKC途径来发挥神经保护作用，同时Akt活化后是通过Akt-IIK-NFκB-XIAP途径还是通过直接磷酸化XIAP的Ser87位点，又或是通过Caspase-9和第二个线粒体源性caspase激活剂(second mitochondrial derived activator of caspase,Smac/DIABLO)在XIAP显现效能时起到了重要的调整作用，这些问题在本实验中尚未阐述。信号转导途径的“cross-talk(交谈)”效应纷繁复杂，这就需要进一步的扩大样本量，寻求多位点观察，以便掌握其更精细的调控机制，这些都需要在进一步实验研究中逐步完善，以期为神经系统乃至各个系统的临床应用提供重要的实验依据。

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(本文编辑：崔沙沙)

·全科医生知识窗·

标准·方案·指南

——《CVD合并糖尿病OAD应用专家共识》解读

共识建议，成人具有下列任何一项及以上危险因素，可被定义为糖尿病高危人群，应进行糖尿病筛查：有糖调节受损史；年龄≥40岁；超重(BMI≥24 kg/m2)或肥胖(BMI≥28 kg/m2)和/或向心性肥胖(男性腰围≥90 cm,女性腰围≥85 cm)；2型糖尿病患者的一级亲属；高血压〔血压≥140/90 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)〕或正在接受降压治疗；血脂异常或正接受调脂治疗；动脉粥样硬化性心血管疾病患者及其他因素等。筛查措施包括空腹血糖(FPG)、口服葡萄糖耐量试验(OGTT)和糖化血红蛋白(HbA1c)检测等。

共识建议，糖尿病血糖控制可根据自我血糖监测(SMBG)的结果和HbA1c综合判断。血糖控制目标为：HbA1c<7.0%，FPG<7.0 mmol/L，餐后2 h血糖(2 hPG)<10 mmol/L；糖尿病病史较短、预期寿命较长、无并发症的患者，在不发生低血糖的情况下可考虑将HbA1c控制在<6.5%，否则可放宽血糖目标值至<7.5%～8.0%；慢性疾病终末期患者的HbA1c可放宽至<8.5%。

共识列出了目前常见的心内科临床应用的各种口服降糖药物(OAD)包括：双胍类、磺脲类胰岛素促泌剂、格列奈类胰岛素促泌剂、α-糖苷酶抑制剂、二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂和噻唑烷二酮类等。除一线用药外，共识还推荐了联合用药方案。指出如果起始HbA1c≥9.0%或生活方式干预联合一线OAD单药治疗3个月不能使血糖达标，需联合OAD治疗；若两种OAD联合治疗3个月不能使患者血糖达标，可考虑联合第3种OAD，或者联合胰岛素或胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂治疗。共识强调，选择联合用药方案应根据患者的情况。欧洲心脏病学会(ESC)/欧洲糖尿病研究学会(EASD)糖尿病、糖尿病前期和心血管疾病指南也指出，应根据糖代谢异常的特点选择降糖药物。

(摘自《中国医学论坛报》)

Effects of rHuEPO on the Regulatory Factors Related With the Apoptosis Pathway of Hippocampal Mitochondria in Rats With Status Epilepticus and the Possible Mechanism

SHIZhi-qin,BIANHong-lei,WEIYan-jing,etal.

HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China

Objective To observe the effect of recombinant human erythropoietin(rHuEPO) on the expression levels of p-PKB/p-Akt,Bax and XIAP in hippocampal neurons of male mature SD rats with pentylenetetrazol(PTZ) induced status epilepticus(SE),and to further investigate the possible mechanism.Methods The included male mature rats of clean grade were provided by Laboratory Animal Center of Hebei Province in March 2010.By using the PTZ kindling epileptic rat SE model,the SD rats were divided into four groups:group B(PTZ+0.9% sodium chloride solution),group C (PTZ+rHuEPO)，group D (PTZ+LY294002+rHuEPO)and group E(PTZ+dimethyl sulfoxide+rHuEPO).Meanwhile, we assigned SD rats without SE model building into group A(0.9% sodium chloride solution).The behavioral and EEG changes were detected;TUNEL was used to check the apoptosis status of hippocampal neurons;immunohistochemistry was used to observe the number of cells with positive p-Akt,Bax and XIAP;the RT-PCR method was used to detect the expression level of BaxmRNA in hippocampus;Western blot method was employed to detect the protein expression levels of Akt,p-Akt and XIAP.Results Compared with group B,group C was higher(P<0.05) in the number of cells with positive p-Akt and XIAP,the protein expression levels of p-Akt and XIAP and was lower in the number of cells with positive Bax and the protein expression level of BaxmRNA.Compared with group C,group D was lower in the number of cells with positive p-Akt and XIAP and the protein expression levels of p-Akta and XIAP and was higher(P<0.05) in the number of positive cells with positive Bax and the expression level of BaxmRNA.Conclusion rHuEPO can increase the number of cells with positive p-Akt and XIAP and the protein expression of p-Akt and XIAP.It can also decrease the number of cells with positive Bax and the expression level of BaxmRNA,reduce the apoptosis of hippocampal neurons,and has a neuroprotective effect.When PI3K inhibitor LY294002 is added,the number of cells with positive p-Akt and XIAP and the protein expression of p-Akt and XIAP decrease,the number of cells with positive Bax and the expression of BaxmRNA increase,the apoptosis of hippocampal neurons increases,and the neuroprotective effect of rHuEPO is weakened.Therefore,the signal path of PI3K/Akt may be one of the neuroprotective ways of rHuEPO.The possible mechanism may be that rHuEPO activating the PI3K/Akt increases the expression levels of p-Akt and XIAP,decreases the expression level of Bax,thus mediating the path of mitochondrial apoptosis and playing a neuroprotective role of anti-apoptosis and survival promotion.

Status epilepticus;Recombinant human erythropoietin;Phosphatidylinositol 3-kinases;Protein kinases；Bcl-2-associated X protein；X-linked inhibitor of apoptosis protein

河北省自然科学基金资助项目(C2007000852)

050000河北省石家庄市，河北医科大学(史志勤，魏艳静，尹晓琳，张荣)；河北医科大学第三医院肛肠科(卞红磊)；河北省中医院(梁文杰)；河北医科大学第二医院神经内科(刘瑞春，王维平,于江华)

于江华，050000河北省石家庄市，河北医科大学第二医院神经内科；E-mail:1668834810@qq.com

R 349.53

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.19.016

2015-03-02；

2015-05-25)