转OsDREB3基因大豆外源基因拷贝数的确定及标准分子的构建

孙喆，刘营，张明辉，李璐，高学军

(农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心(哈尔滨)，东北农业大学农业生物功能

基因重点实验室，黑龙江 哈尔滨　150030)

转OsDREB3基因大豆外源基因拷贝数的确定及标准分子的构建

孙喆，刘营，张明辉，李璐，高学军

(农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心(哈尔滨)，东北农业大学农业生物功能

基因重点实验室，黑龙江 哈尔滨150030)

摘要：为建立抗逆转OsDREB3基因大豆快速稳定的品系特异性检测方法，本试验通过实时Real-time PCR方法，以大豆凝集素基因(lectin)作为内源参照基因，确定了外源基因OsDREB3在转OsDREB3基因大豆基因组中的拷贝数为单拷贝，为建立快速、有效的品系特异性检测方法奠定基础.同时，在原有构建的含4种转基因大豆品系特异性序列的标准分子载体上又增加了转OsDREB3基因大豆品系特异性序列，新构建了含有5种转基因大豆品系特异性序列的标准分子及大豆内参照基因(lectin)，已完全满足对现有国内覆盖面最大的5种转基因大豆同时、快速筛查检测工作的需要.

关键词：转OsDREB3基因大豆；外源基因；拷贝数；标准分子

第一作者：孙喆(1980-)，女，实验师，硕士，从事转基因检测技术方面的研究.E-mail:sunzhe1998@163.com

Determination of copy numbers ofOsDREB3 gene

and construction of standard molecular of

transgenicOsDREB3 soybean

SUN Zhe,LIU Ying,ZHANG Ming-hui,LI Lu,GAO Xue-jun

(Superivision and Test Center (Harbin) for Molecular Characteristics of Genetically Modified Plants,

Ministry of Agriculture,Key Laboratory of Agricultural Genomics,Northeast

Agricultural University,Harbin 150030,China)

Abstract：To establish a fast and stable detection method for OsDREB3,a genetically modified (GMO) soybean,t the exogenous gene OsDREB3 was identified as a single copy gene in the genome by real-time quantitative PCR method and lectin gene as house-keeping gene,which laid a foundation for a rapid and effective detecting method of event specific genetically modified soybeans.At the same time,OsDREB3 event specific sequences were constructed to the multiple-target plasmid,a standard plasmid with four junction regions of genetically modified soybean events,and thus generate a new standard plasmid which can meet fully the demands of rapid detection work of all the five kinds of genetically modified soybeans.

Key words：OsDREB3 transgenic soybean;exogenous gene copy number;standard molecular

自1988年Hinchee首次报道成功获得大豆转基因植株以来，1994年美国孟山都公司成功研制出抗草甘膦除草剂转基因大豆(RR大豆)，1995年获准在美国商业化种植，转基因大豆在国际上的种植面积不断增加[1].我国已经成为最大的转基因大豆进口国.随着基因工程技术的不断提高，转基因大豆的类型也在不断增加[2].目前，我国主要转基因大豆类型有‘GTS40-3-2’‘A2704-12’‘A5547-127’‘MON89788’等，农业部已出台了相应的检测标准[3-6].由于地理环境的因素和优越的抗逆性能，抗逆转基因大豆越来越受到科研人员的重视.本研究所用的转OsDREB3基因大豆是从水稻中分离得到的抗逆基因转入到大豆中，以提高大豆的抗逆性状.近年来，耐低温抗逆转基因大豆新品系‘OsDREB3’由于优秀的抗逆性状，已进入环境释放或生产性试验、或获得安全证书的转基因植物环境安全评价阶段.因此，建立其快速、有效的转基因检测技术已成为迫切解决的问题.本研究中构建的含有转基因大豆品系特异性基因片段的标准分子，能够同时、快速、有效的对5种转基因大豆进行检测，获得的转OsDREB3基因大豆拷贝数及方法将为我国转基因大豆安全评价做出一定贡献.

1材料与方法

1.1试验材料

转OsDREB3基因大豆由东北农业大学大豆研究所提供；转基因品种大豆‘MON89788’、转基因大豆‘A2704-12’、转基因大豆‘A5547-12’、转基因大豆‘GTS 40-3-2’及非转基因大豆由农业部生物产品成分监督检验测试中心(哈尔滨)提供.

1.2试剂与仪器

dNTP、rTaqDNA聚合酶、Marker DL2000、DNA纯化试剂盒，购自Axygen公司；定量PCR试剂盒，pMD18-T质粒及所需试剂购自大连宝生物工程有限公司；DNA Clontech Genome WalkerTM Universal Kit.引物合成和测序由Invitrogen公司完成.

PCR仪(德国Biometra，BiometraTgradient)、高速离心机(上海安亭，TDL-40B)、紫外分光光度仪(美国Beckman，DUR640)、凝胶成像系统(美国UVP，G8000)、核酸电泳仪(杭州大和热磁，GE-100)、核酸蛋白分析仪(DU 640，Beckman coulter).

1.3试验方法

1.3.1DNA提取采用CTAB法，将100 mg样品经预处理后提取总DNA[7].提取的总DNA溶于100 μL ddH2O中，测定其浓度后最终稀释成100 ng/μL备用.用紫外分光光度计测定DNA溶液的D260与D280值，并计算D260/D280的比值来评价所提取DNA的质量，本研究中所用DNA的D值均在1.9左右.

1.3.2转OsDREB3基因大豆外源基因拷贝数的确定

1.3.2.1品系特异性PCR引物设计以NCBI GeneBank序列为基础.根据大豆内标准基因lectin基因序列(GeneBank序列号：K00821)、质粒pCAMBIA 1301(GenBank AF234297)和OsDREB3基因序列(GeneBank序列号：AY781349.1)，根据转OsDREB3基因大豆 5’旁侧序列，采用Primer 5.0设计引物[8].质粒标准品的构建及计算拷贝数所用引物见表1.

表1　质粒标准品构建及拷贝数所用引物序列及扩增片段大小

1.3.2.2内参基因和外源基因标准曲线的构建

1)内参lectin标准曲线的绘制试验标准品选用非转基因大豆做内参基因lectin标准对照，进行51，52，53，54，55梯度稀释，经过Real-time PCR反应，获得lectin基因标准曲线、扩增曲线.

2)OsDREB3标准曲线的构建选用含OsDREB3阳性质粒为标准对照，进行51，52，53，54，55梯度稀释，经过Real-time PCR反应，获得OsDREB3基因标准曲线.

1.3.2.3OsDREB3基因拷贝数的估算为排除其它因素的影响，保证试验结果真实、有效，每个模板做3个平行，进行Real-time PCR扩增，获得内参lectin基因Ct值与拷贝数对数值的相关标准曲线和OsDREB3基因Ct值与拷贝数对数值的相关性标准曲线，OsDREB3基因与内参基因lectin起始量比值即是OsDREB3在大豆基因组中的拷贝数.

1.3.3转基因大豆标准分子构建

1.3.3.1引物设计标准分子所用引物的设计以NCBI GeneBank序列为基础.依据OsDREB3基因序列(GeneBank序列号：AY781349.1)，引物采用Primer 5.0设计，新构建的标准分子所用引物见表2.为了构建含有OsDREB3特异片段的标准分子，将OsDREB3外源基因扩增后得到的片段大小700bp的特异片段连接到本实验室自构建的商品化转基因大豆阳性对照分子上[9].

表2　新标准分子所用的引物

1.3.3.2阳性标准分子的鉴定以重组质粒作为模板，琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带.

2结果与分析

2.1转OsDREB3基因大豆拷贝数的确定

2.1.1内参基因标准曲线的制作内参基因标准样品选用非转基因大豆，提取DNA后分别进行51，52，53，54，55梯度稀释，经过Real-time PCR反应，得到各自的Ct值，通过Ct值与起始模板数的对数值之间存在的线性关系，获得标准曲线方程.lectin基因含量标准曲线见图1.转OsDREB3基因大豆内参照基因以待检x为LogDNA分子数，y为Ct值，建立了内参照基因标准曲线.标准曲线如图1所示.内参照基因lectin标准曲线方程为y=-2.708x+38.896，R2= 0.995.标准曲线的相关系数R2接近1.

2.1.2OsDREB3基因标准曲线的制作制作OsDREB3基因标准曲线样品选用OsDREB3表达载体质粒DNA，分别进行51，52，53，54，55梯度稀释，经过Real-time PCR反应，得到各自的Ct值，通过Ct值与起始模板数的对数值之间存在的线性关系，获得标准曲线方程.OsDREB3基因含量标准曲线见图2.转OsDREB3基因大豆外源基因以待检x为LogDNA分子数，y为Ct值，建立了外源基因的标准曲线，如图2所示.外源基因OsDREB3基因标准曲线方程为y=-3.679x+42.670，R2= 0.999，标准曲线的相关系数R2接近1.

图1　lectin基因标准曲线

图2　OsDREB3基因含量标准曲线

2.1.3OsDREB3基因拷贝数的计算采用CTAB法提取基因组，经0.8%琼脂糖凝胶电泳(图3)，显示基因组无蛋白质和RNA污染.

图3　OsDREB3 DNA基因组凝胶电泳图

采用绝对定量法计算转OsDREB3基因大豆中基因边界序列的拷贝数，检测样品做3个平行，获得扩增曲线，荧光阈值的设定与制作标准曲线时相同.表3为采用7300分析软件得到的样品的Ct值及分子数.拷贝数的计算依照公式：拷贝数=待测品中外源基因分子数/(待测品中内参基因分子数×2).根据表4所得Ct值及拷贝数公式计算得，转OsDREB3基因大豆拷贝数为1，即单拷贝.

表3　依据Lectin、OsDREB3基因的标准曲线所获得的样品Ct值及分子数

2.2转OsDREB3基因大豆标准分子的构建

2.2.1目的基因的扩增选择优化好的PCR条件扩增转OsDREB3基因大豆的目的基因.目的基因为覆盖大豆基因组及载体序列的一段特异片段，大小为700 bp(图4).

2.2.2酶切将OsDREB3质粒和原有标准分子经琼脂糖凝胶电泳后回收，将回收后的OsDREB3基因目标片段与实验室原有标准分子载体进行用限制性内切酶SalⅠ和HindⅢ进行酶切，可得到大片段的原有标准分子和小片段的OsDREB3特异扩增产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳结果可见与预期片断大小一致的目的基因片段及酶切质粒片断(图5).

M：DL2000；1：空白；2～3：OsDREB3.

M：DL2000；1：原有标准分子酶切结果；2：OsDREB3质粒酶切结果.

图5原有标准分子质粒和OsDREB3质粒经

SalⅠ和HINDⅢ酶切后电泳图

Fig.5Result of original standard molecular plasmid and

OsDREB3 plasmid with enzyme digestion

2.2.3新质粒的验证以新构建的质粒为模板，用不同转基因大豆特异性引物进行普通PCR扩增，扩增电泳结果如图6所示，条带清晰，所扩增片段大小与预期扩增片段大小一致，表明所构建的新标准分子准确、有效.

M：M：DL-2000；1：GTS40-3-2；2：lectin基因；3：A2704-12；4：A5547-127；5：OsDREB3；6：MON89788.

图6标准分子目的片段PCR扩增

Fig.6PCR amplification of standard molecular fragment

3讨论

3.1转OsDREB3基因大豆拷贝数的确定

在新的转基因植物研究过程中，由于外源基因随机插入的数量影响其表达，有时甚至会造成外源基因沉默.因此拷贝数对于由于外源基因随机插入而获得的转基因转化植株的分子生物学性状的研究非常重要.近年来,利用高通量、快速、灵敏的Real-time PCR方法检测转基因拷贝数逐渐受到科研人员的青睐[10-11].获得转基因植株外源基因拷贝数的方法很多，如Southern Blot方法就是最常用的转基因植株外源基因拷贝数获得方法，此外还有CGH、FISH、Micro array等方法也常用于外源基因拷贝数的分析.但是这些方法均存在许多不足，例如，对于发生基因重排的外源基因检测不够准确，需要的DNA模板量多、且检测时工作量大并且费时，甚至使用放射性同位素[12-15].Askild[16]采用5’核酸酶PCR方法获得了转基因玉米MON810拷贝数为单拷贝，是一种新型的定量方法，较Real-time PCR方法更适合转基因深加工制品.基于Real-time PCR方法建立起来拷贝数分析方法，具有克服以上各种弊端的优点.研究发现,虽然在利用Southern杂交和荧光实时定量PCR这2种方法检测转基因拷贝数时结果十分接近，但杨力桃等试验证实，分别采用Southern Blot方法和Real-time PCR分析方法来确定分析转基因水稻植株中的HPT或GUS基因的拷贝数时，结果显示定量PCR的方法对于分析转基因拷贝数更加有效、适用[17-18].因此，本试验选择Real-time PCR方法来确定转OsDREB3基因大豆的拷贝数.

本试验在分析过程中，样品设置3个重复以尽量减少误差，以克服Real-time PCR反应过程中起始模板数微小的差异或是反应效率的微小变化而导致结果产生较大幅度的偏差.理论上来说，转OsDREB3基因大豆通过Real-time PCR方法得到的基因拷贝数为1，可能更接近于客观事实，因为只有基因重排才有可能影响拷贝数的结果.

3.2转OsDREB3基因大豆标准分子的构建

作为转基因产品监管的重要技术支撑之一，核酸检测技术已成为转基因生物检测的最主要和常用的方法.而不论采用基于核酸还是蛋白质的方法，在转基因生物检测时均必须使用标准物质(reference materials)作为阳性对照或制作标准曲线，以对转基因产品进行准确检测[19-20].

标准分子构建的原理是将OsDREB3基因转化体特异序列克隆到以pMD18-T为载体的本实验室阳性标准分子上的HINDⅢ/SalⅠ位点，以此获得的质粒作为定性检测转GTS40-3-2基因大豆、转MON89788基因大豆、转A5547-127基因大豆、转A2704-12基因大豆以及转OsDREB3基因大豆的新标准分子，以此代替转基因大豆检测中的阳性对照样品.

标准物质是具有一种或多种足够稳定、均一和确定的特性值，用于对设备进行校准、评价测量方法或为材料定值的物质和材料.国外研究机构中标准物质较多，购买标准物质不仅周期长、价格昂贵，而且在实际使用中品种不全，不能满足国内日常检测需求.标准分子(reference molecule)一般包含转基因作物检测的特异性片段及物种特异的内源标准基因片段，是一种重组质粒分子.由于其制备容易、简便，并可通过细菌扩繁而获得大量纯度较高的DNA样品，已开始作为标准物质应用于转基因检测[21].由于操作简便、生产成本低、容易获得高纯度和高浓度 DNA样品，且在一个标准分子中可容纳多个目标序列等突出优点，近年来，标准分子被认为是解决转基因作物检测标准物质缺乏的有效途径之一，已作为新型 DNA标准物质用于转基因作物检测和定量分析[22-23].

阳性质控对照在转基因产品检测过程中发挥着监控PCR体系工作正常与否的作用，是辨别假阴性和假阳性结果的重要依据之一.随着转基因检测工作越来越广泛，对阳性质控的需求量也越来越大.质粒标准分子作为新型阳性质控对照，以环形DNA状态存在,可通过寄主菌株无限复制，且提取纯化的方法简便、用量少，完全能满足检测工作需求量[24-26].

近年来，我国有关转基因作物标准分子的研究开展了许多，得到了许多性质稳、效率高的转化事件标准分子.如GTS40-3-2、MON89788、MON1445、MON531、MON810、MON863、NK603、Bt11等单个外源基因的转基因作物标准分子[27-30]；敖金霞等[20]构建了定性检测转基因大豆、玉米、水稻的通用标准分子质粒；Yang[19]构建了含有9种转基因玉米外源基因的标准分子，上述标准分子涵盖了多数大规模商业化的转基因作物，但尚未建立含有转OsDREB3基因大豆转化事件的标准分子.本试验在目前实验室现有的包括所有商品化转基因大豆标准分子上又构建了OsDREB3转化体特异事件，从而完善了现有转基因大豆标准分子在OsDREB3抗旱基因检测方面的不足，为我国建立转OsDREB3基因大豆标识管理制度提供参考.

参考文献

[1]王灿．非产业化转基因大豆的研究概况[J]．农业科技与信息，2010，19:13-14

[2]张兵，李丹．论转基因大豆对我国大豆产业的影响[J]．西北农林科技大学学报：社会科学版，2012，12(6):98-104

[3]农业部1485号公告-6-2010．转基因植物及其产品成分检测耐除草剂大豆MON89788及其衍生品种定性PCR方法[S]．北京:中华人民共和国农业部，2010

[4]农业部1485号公告-8-2010．转基因植物及其产品成分检测耐除草剂大豆A5547-127及其衍生品种定性PCR方法[S]．北京:中华人民共和国农业部，2010

[5]农业部1485号公告-7-2010．转基因植物及其产品成分检测耐除草剂大豆A2704-12及其衍生品种定性PCR方法[S]．北京:中华人民共和国农业部，2010

[6]农业部1861号公告-2-2012．转基因植物及其产品成分检测耐除草剂大豆GTS 40-3-2及其衍生品种定性PCR方法[S]．北京:中华人民共和国农业部，2012

[7]农业部1485号公告-4-2010．转基因植物及其产品成分检测 DNA提取和纯化[S]．北京:中华人民共和国农业部，2010

[8]Liu Y,Zhang M H,Yu Y B,et al．Event-Specific Qualitative and Quantitative Detection in Transgenic Soybean OsDREB3Based on the 5’ Flanking Sequence[J]．Food Biotechnology，2014,28:63-78

[9]Qiu Y W,Zhang M H,Yu Y B,et al．The construction of pMD18-HT-Soybean as a calibrator plasmid and nested PCR assay for herbicide tolerant soybeans[J]．Eur Food Res Technol，2013，10:1-22

[10]Weng H B,Pan A H,Yang L T,et al．Estimatingnumber of transgene copies in transgenic rapeseed by realtime PCR assay with HMG I / Y as an endogenous reference gene[J]．Plant Molecular Biology Reporter,2004,22:289-300

[11]Mason G,Provero P,Vaira A M,et al．Estimating the number of integrations in transformed plants by quantitative real-time PCR[J]．BMC Biotechnol,2002,2:20

[12]Song P,Cai C,Skokut M,et al．Quantitative real-time PCR as a screening tool for estimating transgene copy number in WHISKERSTM-derived transgenic maize[J]．Plant Cell Reports,2002,20:948-954

[13]Cao J J,Qin W,Zhu S F,et al．Identification for genetically modified maize T14/T25 with real time fluorenscent PCR method[J]．Hereditas,2004,26( 5):689-694

[14]杨立桃，赵志辉，丁嘉羽，等．利用实时荧光定量PCR方法分析转基因水稻外源基因拷贝数[J]．中国食品卫生杂志，2005，17(2):140-144

[15]Ji W,Zhou W L,Abruzzese R,et al．A method fordeterminingzygosity of transgenic zebrafish by TaqManrealtime PCR[J]．Analytical Biochemistry,2005,344:240-246

[16]Askild Holck,Marc Va,Luc Didierjean,et al．5'-Nuclease PCR for quantitative event-specific detection of the genetically modified Mon810 Mais Gard maize[J]．Eur Food Res Technol，2002，214:449-453

[18]Ding J Y,Jia J W,Yang L T,et al．Validation of a rice specific gene,sucrose phosphate synthase,used as the endogenous reference gene for qualitative and real-time quantitative PCR detection of transgenes[J]．Journal of Agricultural and Food Chemistry,2004,52( 11):3372-3377

[19]Yang L，Guo J，Pan A，et al．Event-specific quantitative detection of nine genetically modified maizes using one novel standard reference molecule[J]．J Agric Food Chem，2007，55( 1):15-24

[20]敖金霞，高学军．转基因大豆、玉米和水稻外源基因检测通用标准分子的构建[J]．中国农业大学学报，2008，13( 6):19-24

[21]Corbisier P,Broeders S,Charels D,etal．Validation report．Certification of plasmidic DNA containing MON 810 maize DNA fragments[R/OL]．European Commission,Joint Research Centre,Institute for Reference Materials and Measurements,EUR22948EN-2007,http://www.erm-crm.org/html/ERM-products/search/reports/AD413.pd,f 2007

[22]沈愷琳，李想，王姝，等．四种转基因玉米新型质粒标准分子协实验验证[J]．中国农业科技导报，2009，11(5):2-6

[23]Zhang H，Yang L，Guo J，et al． Development of one novel multiple-target plasmid for duplex quantitative PCR analysis of Roundup Ready soybean[J]．J Agric Food Chem，2008，56(1):5514-5520

[24]Debode F,Mariena,Janssen E．Design of multiplex calibrant plasmids,their use in GMO detection and the limit of their applicability for quantitative purposes owing to competition effects[J]．Analitical and Bio-analytical Chemistry,2010,396:2151-2164

[25]Taverniers I,Windels P,Vaitilingom M,et al．Event specific plasmid standards and real-time PCR methods fortransgenicBt11,Bt176and GA21maize and transgenicGT73 canola[J]．Journal of Agricultural Food Chemistry,2005,53:3041-3052

[26]Mattarucchi E,Weighardt F,Barbati C,et al．Development and applications of real-time PCR standards for GMO quantification based on tandem-marker plasmids[J]．European Food Research Technology,2005,221(3):511-519

[27]Burns M,Corbisier P,Wiseman G,et al．Comparison of plasmid and genomic DNA calibrants for the quantification of genetically modified ingredients[J]．European Food Research Technology,2006,224(2):249-258

[28]Akiet,Hiroshia,Mitsunori S,et al．Quantification of genetically modified soybeans using a combination of a capillary-type real-time PCR system and plasmid reference standard[J]．Bioscience Biotechnology & Biochemistry,2006,70(4):821-827

[29]Yang L T,Xu S C,Pan A H,et al．Event specific qualitative and quantitative polymerase chain reaction detection of genetically modified MON863 maize based on the 5'-transgene integration sequence[J]．Journal of Agriculture and Food Chemistry,2005,53(24):9312-9318

[30]李飞武，李葱葱．转基因大豆MON89788转化体特异性定性PCR检测[J]．安徽农业科学，2010，38(13):6679-6682

(责任编辑李辛)

收稿日期：2014-06-30；修回日期：2014-07-16

基金项目：转基因生物新品种培育重大专项(2014ZX08004-002-002)；农业生物功能基因重点实验室基金开放课题项目(NSGJ2012-08).

通信作者：刘营，女，助理研究员，博士，从事转基因检测技术方面的研究.E-mail:lyneau@126.com

中图分类号：Q 78

文献标志码：A

文章编号：1003-4315(2015)03-0061-07