黄芪多糖对脑缺血再灌注大鼠脑组织Caspase-3表达及形态学的影响

王琰，马兴铭，苏韫

(1.兰州大学基础医学院，甘肃 兰州　730000；2.甘肃省妇幼保健院，甘肃 兰州　730050；

3.甘肃中医学院，甘肃 兰州　730000)

黄芪多糖对脑缺血再灌注大鼠脑组织Caspase-3表达及形态学的影响

王琰1，马兴铭1，苏韫2

(1.兰州大学基础医学院，甘肃 兰州730000；2.甘肃省妇幼保健院，甘肃 兰州730050；

3.甘肃中医学院，甘肃 兰州730000)

摘要：为了探讨黄芪多糖(Astragalus polysaccharide，APS)对大鼠脑缺血再灌注损伤脑组织Caspase-3表达及形态学的影响.选取SPF级Wistar大鼠72只，随机分为假手术组、模型对照组、阳性药物对照组、黄芪高剂量组、黄芪中剂量组、黄芪低剂量组，每组12只；采用改良线栓法建立大鼠脑缺血再灌注模型，各药物组分别给予相应药物15 d，后处死检测， HE染色观察各组大鼠脑组织形态学变化，免疫组化法检测各组大鼠脑组织中Caspase-3蛋白的表达水平.结果表明：假手术组大鼠Caspase-3表达较弱，模型组较假手术组明显增多(P<0.01)；与模型组比较，其余各组大鼠的Caspase-3表达均有显著减少(P<0.05)，以黄芪多糖高剂量组大鼠尤为明显.形态学试验结果表明模型组大鼠可见神经元大片消失，间质疏松，残余细胞胞核固缩、染色质凝聚，其余各组神经元细胞发生凋亡的程度较模型组轻，以黄芪高剂量组效果明显.说明黄芪多糖能显著抑制脑缺血再灌注损伤后的神经细胞凋亡，其作用可能是通过降低Caspase-3的表达实现的，且作用效果呈剂量依赖性.

关键词：大鼠；脑缺血再灌注；黄芪多糖；Caspase-3；凋亡

第一作者：王琰(1977-)，男，主治医师，主要从事中医药免疫学及辅助生殖技术.E-mail：ailya23@126.com

Effects of Astragalus Polysaccharides on Caspase-3 expression

and morphology in rats brain tissue after cerebral

ischemia reperfusion

WANG Yan1,MA Xing-ming1，SU Yun2

(1.College of Basic Medical Sciences,Lanzhou University,Lanzhou 730000,China;2.Gansu Provincial

Maternity and Child Care Hospital,Lanzhou 730070,China;3.Gansu University of

Chinese Medicine,Lanzhou 730000,China)

Abstract：In order to study the effects of Astragalus polysaccharides on Caspase-3 expression and morphology in rats brain tissue after cerebral ischemia reperfusion,72 SPF level Wistar rats were randomly divided into 6 groups,sham operation group,model group,positive control group,Astragalus polysaccharides high dose group,Astragalus polysaccharides middle dose group and Astragalus polysaccharides low dose group,12 rats in each group.With modified thread embolism method,the cerebral ischemia reperfusion models of rats were established.Each drug group was respectively given corresponding medicine for 15 days,and was detected after put to death.The changes of rats brain tissue in each group were observed by HE staining,and the expression level of Caspase-3 protein in rats brain tissues were detected with immunohistochemical method.The results showed that Caspase-3 expression was weak in artificial surgery group,which was much stronger in model group (P<0.01).Compared with model group,Caspase-3 expression amount of other groups were obviously less (P<0.05,P<0.01),particularly in Astragalus polysaccharides high dose group.The morphological changes in model group appeared obvious apoptosis,neurons disappear,mesenchyme loosen,karyopyknosis and chromatin condensation,nerve cell apoptosis of other groups were less worse than that of model group,especially obvious in Astragalus polysaccharides high dose group.The study showed that Astragalus polysaccharide could significantly inhibited nerve cell apoptosis,this should be realized by reducing the expression of Caspase-3,and the inhibition effect was dose-dependent.

Key words：rat;cerebral ischemia reperfusion;Astragalus polysaccharides;Caspase-3;apoptosis

近年来，人们对脑缺血再灌注损伤进行了广泛深入的研究，发现蛋白酶激活、基因表达的改变、兴奋性氨基酸的释放、钙超载、蛋白合成受抑、热休克蛋白表达受阻、自由基形成等过程都参与了脑缺血再灌注后神经元的凋亡，但其详细机制仍未完全明确.有研究发现，Caspase-3蛋白参与了脑缺血后神经元损伤的病理过程，在脑缺血中再灌注损伤起重要的作用[1].黄芪多糖是黄芪的主要活性成分之一，具有补气升阳、益卫固表、托毒生肌、利水消肿等功效[2].可作为免疫促进剂或调节剂，同时具有增强机体抵抗力、促进抗体合成、双向调节血糖和保护心血管系统等作用，广泛应用于中医临床[3].

本试验旨在通过研究黄芪多糖对大鼠脑缺血再灌注后脑组织Caspase-3表达及脑组织形态结构的影响，来推测黄芪多糖可能的药理作用机制，以期为临床用药提供科学依据.

1试验材料

1.1试验动物

SPF级Wistar大鼠72只，体质量(300±30)g，雌雄各半，由甘肃中医学院科研实验中心提供，动物实验设施使用证号：SYXK(甘)2011-0001，试验动物质量合格证号：SCXK(甘)2011-0001-0001343.

1.2试验试剂

兔抗大鼠Caspase-3多克隆抗体(BA2142)(武汉博士德生物工程有限公司，批号201203)；SABC(兔IgG)免疫组化试剂盒(SA1022)(武汉博士德生物工程有限公司，批号201203)；DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，批号201203).

1.3试验药物

黄芪多糖(Astragaluspolysaccharide，APS)由甘肃中医学院科研实验中心药物提取与分离实验室提供，由甘肃中医学院科研实验中心药物鉴定实验室检验并鉴定，其纯度达到50%以上.对照药物：尼莫地平，浙江仙琚制药股份有限公司,国药准字H33021207，批号110810.青霉素，华北制药股份有限公司，批号110912.

1.4试验仪器

CX31型生物显微镜(日本Olympus optical Co.LTD)；山东易创MiE图像处理系统(山东易创电子有限公司)；成都泰盟BI-2000医学图象分析系统(成都泰盟科技有限公司).

2试验方法

2.1动物分组

72只Wistar大鼠随机分为6组，假手术组、阳性对照组、脑缺血再灌注模型组、黄芪多糖高剂量组、中剂量组、小剂量组，每组12只.

2.2给药剂量及方法

黄芪多糖给药剂量：高剂量组120 mg/kg；中剂量组60 mg/kg；低剂量组30 mg/kg；临用前分别用生理盐水配制成相应浓度的溶液，配药浓度：高剂量1.2%，中剂量0.6%，低剂量0.3%.阳性对照组给予尼莫地平，给药剂量为5 mg/kg，用生理盐水溶液配制.假手术组和模型组给予等体积生理盐水灌胃，各组分别连续给药15 d.

2.3动物模型制备及取材

采用ZeaLonga等[4]报道的线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞局灶性脑缺血再灌注模型.自颈总动脉分叉处向颈内动脉插入栓线约(18.5±0.5)mm，阻断大脑中动脉血流，造成局灶性脑缺血.术后将栓线尾部置于皮下，于6 h后小心抽出栓线实现缺血再灌注.假手术组颈内动脉也插入栓线，但深度仅为6 mm，不阻塞大脑中动脉.麻醉清醒后，参照Longa方法进行5分制评分，达1～3分入组.手术过程中，环境温度保持于(25.0±0.5)℃，术后腹腔注射青霉素钠盐，40 000 U/d，连续注射3 d，以预防感染发生.

造模后24 h对大鼠神经功能评分，参考Longa及Bederson[5]评定神经功能缺损程度的5级4分法标准进行评分，评分为1～3分者，提示模型成功.

各组大鼠按造模给药后第16天称质量后处死，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，分别用0.9%生理盐水、4%多聚甲醛溶液心脏灌注后固定脑组织，以前囟为中心前后1 mm(病变损害的中心)，冠状切取大鼠脑组织，并用4%多聚甲醛溶液4 ℃固定24 h以上切取约3～4 mm厚的脑组织，常规用石蜡包埋，5 μm切片，HE染色，免疫组化法检测Caspase-3蛋白.

2.4图像分析

用光学显微镜(400倍)观察每视野中凋亡细胞数目，Caspase-3阳性反应为棕黄色，位于胞浆的棕色核并有凋亡小体出现的细胞为阳性凋亡细胞.每组随机选取缺血侧皮层6个视野，每组观察6张切片，取平均数作为本组的代表数目.

2.5数据处理

3试验结果

3.1脑缺血再灌注造模大鼠神经功能评分

脑缺血再灌注造模大鼠共计72只，其中1～3分者59只，符合试验标准，提示大鼠脑缺血再灌注造模成功，另有13只不符合试验标准，予以剔除，结果见表1.

3.2脑缺血再灌注造模大鼠死亡率统计

试验大鼠在手术中呼吸、体温维持在正常生理范围，手术视野无明显活动性出血.术后大鼠死亡主要集中在1～3 d，3～7 d后死亡只数明显减少，7～14 d大鼠全身状况好转无死亡或有较少死亡；模型组大鼠死亡率较假手术组高(P<0.05)；各药物组大鼠死亡率较模型组比较有下降趋势，但无统计学差异(P>0.05)(表2).

表1　脑缺血再灌注造模大鼠神经功能缺损

表2　各组大鼠死亡率统计比较

3.3黄芪多糖对各组大鼠脑组织Caspase-3表达的影响

各组大鼠脑组织Caspase-3均有表达，多见于细胞浆内；假手术组大鼠组织Caspase-3表达较弱，模型组较假手术组明显增多(P<0.01)；与模型组比较，各药物组大鼠的Caspase-3表达均有减少(P<0.05)；以黄芪高剂量组尤为明显(P<0.05)(图1).

3.4黄芪多糖对各组大鼠脑组织形态的影响

HE染色光镜观察结果显示：假手术组大鼠脑组织神经细胞间质未见明显水肿，神经元细胞包膜光滑，胞浆丰富，胞核清晰可见，神经纤维走行一致、排列整齐(图2A)；模型组大鼠可见神经元大片消失，间质疏松，残余细胞胞核固缩，染色质凝聚(图2B).各黄芪多糖给药组大鼠神经元细胞，神经细胞凋亡程度较模型组轻，细胞间质未见明显水肿，神经纤维走行可见(图2C).

表3　各组大鼠脑组织Caspase-3阳性细胞计数

#表示与假手术组比较P<0.05；*表示与模型组比较P<0.05.

A：假手术组；B：模型组；C：阳性对照组；D：黄芪多糖高剂量组；E：黄芪多糖中剂量组；F：黄芪多糖低剂量组； ×400.

A：假手术组；B：模型组；C：黄芪多糖高剂量组；HE (×100).

4讨论

细胞凋亡一直是分子生物医学领域的研究热点.近几年，随着人们对脑缺血-再灌注后损伤保护机制的深入研究，发现脑缺血-再灌注后“半暗带”细胞的死亡以凋亡为主.目前研究表明触发凋亡主要途径是通过半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶级联反应.半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶又称为caspases，与细胞凋亡有着密切关系，Caspase-3被认为是细胞凋亡中的最关键的凋亡蛋白酶，caspases介导细胞凋亡的所有途径最终都是通过激活Caspase-3 而完成的，在各种因素启动的凋亡程序中起最后的枢纽作用[6].正常的脑神经元中只有极少量Caspase-3蛋白表达，脑缺血-再灌注损伤可上调Caspase-3前体表达，进而诱发Caspase-3前体去磷酸化，激活Caspase-3活性，最终引起脑皮质神经细胞凋亡[7].因此Caspase-3可被作为细胞凋亡的早期判断指标之一.研究有效药物干预Caspase-3表达，可促进脑缺血再灌注损伤后神经元损伤的修复与再生.中药具有价格低、多靶点、多环节、毒副反应相对较小的特点和优势，在治疗缺血-再灌注损伤的保护作用方面已积累了丰富的经验.已有研究表明[8]黄芪多糖对脑缺血再灌注损伤神经元具有保护作用，能明显减少凋亡细胞的数量.黄芪多糖是传统中药黄芪的主要有效成分，在调节免疫、炎症、保护心血管、抗肿瘤等方面发挥着多种功能[9].

在本试验中，HE染色镜下大鼠脑缺血-再灌注模型组可见神经元细胞大片消失，细胞核固缩，染色质凝聚，可见凋亡小体，提示造模成功；我们用免疫组化法观察脑缺血再灌注后神经元细胞的凋亡蛋白酶Caspase-3在胞浆中的表达，结果发现假手术组可见少量表达，模型组、各试验药物组Caspase-3表达均高于假手术组，进一步提示了Caspase-3的上调参与了脑缺血再灌注损伤[10].而黄芪多糖可降低Caspase-3的含量，减轻神经元凋亡的程度，在试验组中尤以黄芪高剂量组效果明显；因此，黄芪多糖能显著抑制脑缺血再灌注损伤后的神经细胞凋亡，其作用可能是通过降低Caspase-3的活性实现的，且作用效果具有剂量依赖性.

黄芪多糖的很多作用仍有许多分子调节机制还未能完全阐明，还需要更多的研究证实，随着分子生物学的不断发展，黄芪多糖对缺血再灌注损伤机制的新靶点会有进一步深入的研究，在抗细胞凋亡方面具有广阔的应用前景.

参考文献

[1]武亚辉，卫建平， 李光来，等.乌司他丁对大鼠脑缺血再灌注后大脑皮质Bcl-2 Fas Caspase-3表达的影响[J].中国药物与临床，2012，12(2)：173-175

[2]李金田，魏舒畅，刘永琦，等.黄芪多糖对肺纤维化大鼠肺上皮细胞超微结构及自由基代谢的影响[J].中华中医药杂志，2011，26(10)：2360-2362

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[5]李惠.缺血性脑血管疾病[M].北京：北京科学技术出版社,2002：47-57

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(责任编辑赵晓倩)

收稿日期：2015-03-03；修回日期：2015-04-09

基金项目：甘肃省教育厅第二批科研项目(1006B-08)；甘肃中医学院校内中青年基金(BH2010-076).

通信作者：马兴铭，男，教授，博士生导师，主要从事免疫学及中药研究工作.E-mail:whammer@126.com

中图分类号：S 852.16+2

文献标志码：A

文章编号：1003-4315(2015)03-0049-05