半胱胺盐酸盐对泌乳奶牛血液抗氧化能力的影响

刘威，李发弟，赵圃毅，张鹏，于青，王加启，卜登攀

(1.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃 兰州　730070；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养

学国家重点实验室，CAAS-ICRAF农用林业与可持续畜牧业联合实验室，北京　100193；

3.天津梦得集团今日健康乳业有限公司，天津　300400)

半胱胺盐酸盐对泌乳奶牛血液抗氧化能力的影响

刘威1,2，李发弟1，赵圃毅1,2，张鹏3，于青3，王加启1,2，卜登攀1,2

(1.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃 兰州730070；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养

学国家重点实验室，CAAS-ICRAF农用林业与可持续畜牧业联合实验室，北京100193；

3.天津梦得集团今日健康乳业有限公司，天津300400)

摘要：选择48头健康‘荷斯坦’奶牛，按照泌乳天数、胎次、泌乳量相同或相近的原则随机分成4组(CSH0、CSH3、CSH15、CSH30)，每组12头，分别添加半胱胺盐酸盐0、3 g/kg、15 g/kg、30 g/kg(精料干物质基础)，研究半胱胺酸盐对泌乳牛血液抗氧化能力的影响.结果表明：试验期第30天的SOD活性及整个试验期平均值随添加量的升高呈线性显著升高(P<0.05)；随饲喂时间的延长CSH3组GSH-Px活性在4个组中提高幅度最大，但四组间差异不显著；试验期第30天，随添加剂量升高，MDA含量呈显著2次变化(P<0.05)，随着饲喂时间延长，各组内MDA含量均比试验前降低，以CSH15组降低幅度最大；第30天、60天的T-AOC及2次平均值CSH3组均显著高于CSH0组(P<0.05，P<0.01，P<0.01)，而CSH15和 CSH30组T-AOC低于CSH0组，并在第60天达到显著水平(P<0.01)，第60天，随添加剂量的提高T-AOC呈显著性二次变化(P<0.05)，各组的T-AOC随试验时间延长均比试验前提高，但CSH3组提高幅度最大；正式期第14、28、42、56天各组间SCC没有显著差异，随试验时间延长各组内SCC均比试验前提高，以CSH3组提高幅度最小.试验表明，半胱胺盐酸盐可有效提高泌乳奶牛抗氧化能力，缓解乳体细胞数的增加，但具有剂量依赖性，以3 g/kg精料的添加量效果最好.

关键词：半胱胺盐酸盐；奶牛；抗氧化能力；体细胞数

第一作者：刘威(1986-)，男，硕士研究生，主要从事反刍动物营养研究.E-mail：hashouyan2011@163.com

卜登攀，男，副研究员，博士，硕士生导师，主要从事反刍动物营养代谢与调控、牛奶品质改善和瘤胃微生态研究与应用方面的研究.E-mail：burdenpan@gmail.com

Effects of cysteamine hydrochloride on blood antioxidant

ability of lactating dairy cow

LIU Wei1,2,LI Fa-di1,ZHAO Pu-yi1,2,ZHANG Peng3,YU Qing3,WANG Jia-qi1,2,BU Deng-pan1,2

(1.College of Animal Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070，China；2.State Key

Laboratory of Animal Nutrition,CAAS-ICRAF Joint Laboratory of Agroforestry and Sustainable Animal

Husbandry,Institute of Animal Science,Chinese Academy of Agricultural Science,Beijing 100193,

China;3.Jinrijiankang Dairy Co.,Ltd,Tianjin Mengde Group,Tianjin 300400,China)

Abstract：This study was conducted to research the effects of cysteamine hydrochloride (CSH) on blood antioxidant ability of lactating dairy cow.Forty-eight healthy Holstein dairy cows were randomly divided into four groups (n=12/group) according to the principle of similar DIM,parity and milk yield.Cows in four groups were fed a basal diet respectively adding CSH at 0,3,15,30 g/kg.The results indicated that in the 30 th day of the experiment period,the activity of superoxide dismutase (SOD) increased linearly significant with increasing dietary CSH supplementation(P<0.05),the same as means of the entire experiment (P<0.05).The activity of glutathione peroxidase (GSH-Px) in group CSH3increased higher than other groups with the experiment time extension.In the 30 th day,there was a significantly quadratic change of malonaldehyde (MDA) with increasing dietary CSH administration (P<0.05).The contents of MDA of the four groups were lower than before,and group CSH3had the highest range.Total antioxidant capacity (T-AOC) of group CSH3in the 30th day and 60 th day and the means of them were significantly higher than group CSH0(P<0.05,P<0.01,P<0.01).While T-AOC of group CSH15and CSH30were lower than group CSH0,it reached significant level in the 60 th day (P<0.01).A significantly quadratic change of T-AOC with increasing dietary CSH adding appeared in the 60 th day (P<0.05).T-AOC of all groups increased with the experiment time extension,and group CSH3was the optimum.The milk SCC levels of all groups had no significant differences in the 14 th,28 th,42 th and 56th day,but the increasing range of SCC in group CSH3was the minimum.It is suggested that administration of CSH in diets of lactating cow can efficaciously enhanced blood antioxidant ability and relieved the increasing of milk SCC with a dose dependent.The optimum dose was 3 g/kg.

Key words：cysteamine hydrochloride;dairy cow;antioxidant ability;somatic cell count

半胱胺(cysteamine,CS)又称β-巯基乙胺，是天然存在于生物体内的生理调节剂，代谢速度快，终产物为对机体无害的胱胺、半胱胺酸、谷胱甘肽等.CS带有不良气味，在空气中易氧化，生产中一般制成半胱胺盐酸盐(cysteamine hydrochloride，CSH)使用.目前，对CS抗氧化方面的研究结果不尽一致.Hardy认为半胱胺是GSH合成的限制性底物，为GSH的合成提供原料[1].另有学者证明，CS可以通过自身的活泼巯基清除体内自由基，并且提高细胞中GSH的浓度，从而起到抗氧化作用[2-4].但是，有学者认为CS会对机体产生毒性，原因可能是半胱胺诱导产生过氧化氢促使细胞凋亡[5]，或是过氧化氢与低价金属离子反应生成羟自由基而产生毒性[6].CS在生产中应用的效果也不尽相同，‘岭南黄羽肉鸡’种鸡饲喂CS后提高肉仔鸡的抗氧化能力[7]，而饲喂AA肉仔鸡CS时却使抗氧化能力降低，加重氧化损伤[8].何军等发现CS在体外条件下可增强断奶羔山羊肠黏膜细胞清除自由基、抵抗损伤的能力[9].此外，CS灌服小鼠也得到增强抗氧化能力的效果[10].目前，国内外关于CSH对泌乳奶牛抗氧化能力影响的报道尚未见到.本试验从血液抗氧化指标和乳体细胞数入手，探讨不同剂量CSH对泌乳奶牛抗氧化能力的影响，为今后的相关研究提供理论依据.

1材料与方法

1.1试验材料

半胱胺盐酸盐为乳白色微颗粒，采用包被技术制得，主体材料为β-环状糊精，有效成分半胱胺含量30%.

1.2试验动物与试验设计

选择48头健康荷斯坦奶牛，根据泌乳天数、胎次、泌乳量等相同或相近的原则，采用随机区组设计分成4组(CSH0，CSH3，CSH15，CSH30)，日粮分别添加半胱胺盐酸盐：0、3 g/kg、15 g/kg、30 g/kg(精料干物质基础)，具体情况见表1.试验期限为2013年7月15日～2013年10月3日，奶牛适应试验牛舍8 d，预饲期12 d，正试期60 d.

1.3日粮与管理

采用试验牧场现行日粮标准，试验牛群饲喂全混合日粮(TMR)，精料组成及营养水平见表2.阿菲金管道式挤奶系统每天5∶00、13∶00、21∶00挤奶，散栏式饲养，每天6∶30、13∶30、18∶30饲喂，自由采食，自由饮水.奶牛采食时，直接将半胱胺盐酸盐按照添加量饲喂于TMR料上，并搅拌均匀，为防止混料，用固定挡板隔成单个牛料槽.饲喂后0.5～1 h推一次料.

CSH:半胱胺盐酸盐；CSH0、CSH3、CSH15、CSH30：0 g/kg、3 g/kg、15 g/kg、30 g/kg组；半胱胺盐酸盐添加以精料干物质为基础.

表2　精料组成及营养水平(干物质基础)

1.4样品采集与项目测定

试验前和正式试验第30、60天于早晨饲喂前(5∶30左右)采集试验牛尾根静脉血(每次约9 mL)，4 ℃离心(3 000 r/min，15 min)，制备血清，置于冰盒中，立即送检.用紫外分光光度计测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，丙二醛(malon aldehyde，MDA)，谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)，总抗氧化能力(totalantioxidant capacity，T-AOC).由北京中同蓝博临床检验所完成.

试验前和正式期第14、28、42、56 d采集奶样，分早、中、晚3次按4∶3∶3比例混合，每次采集50 mL，加入重铬酸钾防腐，送往北京农业部奶及奶制品质量监督检验测试中心，用中红外分光光度测定法(BactoScan FC CombiFoss 6000,Foss Electric,Hillerd,Denmark)测定体细胞.

1.5数据分析

试验数据统计利用SAS 9.2软件包中的PROC MIXED程序进行方差分析.添加剂量对试验结果的影响进行线性和二次相关关系的差异显著性检验.采用图肯检验(Tukey Test)进行多重比较，显著水平为α=0.05.

2结果与分析

2.1各组奶牛血清抗氧化酶活性

由表3可看出，试验前各组间的SOD活性没有显著差异，正试期第30天、60天及二次测定的平均值没有显著性差异，但第30天测定值和2次平均值随半胱胺盐酸盐添加量增加呈线性显著提高(P<0.05).第30天CSH0和CSH3组SOD活性比试验前有所降低，CSH15和CSH30组比试验前升高，第60天4个组相较试验前都提高，以CSH3组提高最大，平均值方面，相较试验前CSH30组提高幅度最大.

表3　奶牛血清超氧化物歧化酶活性

SEM：平均值标准误.

由表4可看出，试验前CSH15和CSH30组GSH-Px 活性显著高于CSH0和CSH3组(P<0.01).各组间GSH-Px 活性在正式期各阶段及其平均值均没有显著差异，但从组内不同阶段来看，CSH3组GSH-Px 活性随添加时间延长提高幅度最大.

表4　奶牛血清谷胱甘肽过氧化物酶活性

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05).

2.2各组奶牛血清丙二醛含量

试验前各组间MDA含量没有显著差异(表5).正试期第30天，CSH15组MDA含量显著低于CSH0组(P<0.05)，随添加剂量升高存在显著二次变化(P<0.05).各组间MDA含量在第60天和二次均值没有显著差异.随着饲喂时间延长，各组内MDA含量均比试验前降低，从试验期平均值来看，以CSH15组降低幅度最大.

表5　奶牛血清丙二醛含量

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05).

2.3各组奶牛血清总抗氧化能力

试验前CSH3组T-AOC低于CSH0组，同时显著低于CSH15和CSH30组(P<0.05，表6).CSH3组T-AOC在正试期第30天、60天及二次平均值均显著高于CSH0组(P<0.05，P<0.01，P<0.01)，而CSH15和CSH30组T-AOC低于CSH0组，并在第60天达到显著水平(P<0.01).第60天，T-AOC随添加剂量升高呈显著性二次变化(P<0.05).至于组内不同阶段的T-AOC，各组随试验时间延长均比试验前提高，但CSH3组提高幅度明显高于其他组.

表6　奶牛血清总抗氧化能力

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05).

2.4各组奶牛乳体细胞数

由表7可看出，试验前CSH3组SCC显著高于其他组(P<0.01)，而平均值方面，CSH3和CSH30组均显著高于CSH0组(P<0.01).正式期第14、28、42、56天各组间SCC没有显著差异.各组内不同阶段的SCC均比试验前提高，而整个试验期以CSH3组提高幅度最小.

表7　半胱胺盐酸盐对牛乳体细胞数的影响

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05).

3讨论

半胱胺(CS)具有还原性的活性巯基，可以清除氧自由基，具有很强的抗氧化功能.CS可以通过提高动物血液谷胱甘肽(GSH)浓度，发挥其抗氧化功能[11].GSH是体内重要的抗氧化物质，可以作为细胞中重要的自由基清除剂[12]，还参与细胞内合成代谢，拮抗外源性毒物氧自由基损伤，调节机体免疫功能，抑制细胞凋亡.在动物体内，GSH可以直接被氧自由基消耗，也可作为谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的反应底物.GSH-Px与超氧化物歧化酶(SOD)构成生物体内重要的抗氧化酶，SOD是体内清除自由基的首要物质，具有对抗、阻断氧自由基造成的细胞损伤并及时修复受损细胞的作用.SOD与 GSH-Px之间存在着相互保护和协同作用，在协同抗氧化过程中，SOD先将超氧自由基转化为H2O2,再由GSH-Px将H2O2转化为O2，而且GSH-Px通过减少过氧化物对SOD的损害而增强SOD的活性[13].在曹利的研究中，饲喂术后山羊半胱胺盐酸盐(CSH)后，缓解了手术造成的血清GSH-Px活性下降[14].本试验中，虽然整个试验期各组间SOD活性均无显著差异，但第30天测定值和试验期平均值随CSH添加量增加呈线性显著提高(P<0.05)，随添加时间延长CSH3组GSH-Px活性相较其他组大幅度提高.说明CSH有提高奶牛抗氧化酶活性的作用.

在生物体内，自由基作用于脂质发生过氧化，其终产物为丙二醛(MDA)，MDA含量的增加会引起蛋白质和核酸等产生交联聚合，还会造成细胞损伤，MDA在机体内的含量反映脂质过氧化和细胞氧化损伤的程度.Chan等用四氢吡啶处理小鼠产生类似帕金森病症状，小鼠血液MDA含量明显升高，予以低计量CS后，MDA含量升高得到缓解[15].刘华忠等给小鼠灌服CS后，小鼠血浆MDA含量明显下调[10].本试验中，饲喂半胱胺盐酸盐30 d后，与对照组相比各剂量组血清MDA含量明显下降，CSH15组达到显著水平，从整个试验期平均值来看，也以CSH15组降低幅度最大.总抗氧化能力(T-AOC)是衡量机体抗氧化系统的综合指标.肉仔鸡日粮添加CS后可显著提高T-AOC[16].本研究中CSH3组整个试验期T-AOC显著高于对照组，且与试验前相比，CSH3组T-AOC提高幅度明显高于其他组.

此外，从本试验可以看出，第30天MDA含量随添加剂量升高存在显著先降低后升高的二次变化(P<0.05)；T-AOC在第60天和试验期平均值随添加剂量升高存在显著先升高后降低变化(P<0.05，P<0.01)，并且CSH15和CSH30组T-AOC低于对照组.我们知道，半胱胺在机体内会产生过氧化氢和超氧自由基[17]，进而产生一定毒性.本人认为，试验中高剂量添加CSH使其细胞毒性超越了抗氧化作用，导致奶牛抗氧化能力随添加量升高而先升高后降低的结果.

CSH自身的氨基硫醇具有抗氧化作用和细胞保护作用[18]，并且可以通过多种途径增强机体免疫功能.Bamouin等研究围产期奶牛临床型乳房炎时发现，低浓度的血液免疫球蛋白和高的白细胞数量是其发生的重要影响因素[19]，说明临床型乳房炎和免疫系统密切相关.有报道称氧化应激状态会导致乳腺粘膜细胞的完整性受到损伤，进而容易发生乳房炎[20]，说明奶牛乳房炎的发生与机体抗氧化能力也息息相关.已有研究证明奶牛饲喂CSH使免疫功能增强，乳体细胞数降低[21].本研究中试验期各组的乳体细胞数(SCC)均比试验前提高，但CSH3组与其他组相比提高幅度最小，说明添加3 g/kg CSH有效缓解乳体细胞增加，降低了乳房炎发生率，同时CSH3组与其他组相比总抗氧化能力显著提高，证明机体抗氧化能力提高有利于预防乳房炎的发生，与前人研究结果一致.有报道证明半胱胺的作用效果具有剂量依赖性，高剂量半胱胺会对小鼠产生细胞毒性[22].类似的结果在鸡和猪生产中也有发现[8,23-24].本次试验中，试验前CSH15和CSH302组的SCC与对照组没有显著差异，但试验期平均值却明显高于对照组，CSH30组达到显著水平(P<0.01)，并且2组总抗氧化能力出现低于对照组的现象，在试验期第60天达到显著水平(P<0.01)，进一步证明奶牛机体抗氧化能力与乳体细胞数存在负相关性，同时证明饲喂奶牛CSH时同样具有剂量依赖性，高剂量饲喂可能对奶牛造成一定毒副作用.

4结论

1)半胱胺盐酸盐可有效提高泌乳奶牛抗氧化能力，缓解乳体细胞数的增加，降低乳房炎发生率.

2)半胱胺盐酸盐对奶牛抗氧化能力的影响具有剂量依赖性，3 g/kg精料的添加量效果最好，高剂量添加时效果反而降低，其作用机理尚须进一步研究.

参考文献

[1]Hardy I J,Hardy G.Immune-modulating effects of sulfur-containing nutraceuticals[J].Nutrition,2007,23(6):514-516

[2]De Matos D G,Furnus C C.The importance of having high glutathione (GSH) level after bovine in vitro maturation on embryo development:effect of β-mercaptoethanol,cysteine and cystine[J].Theriogenology,2000,53(3):761-771

[3]Messina J P,Lawrence D A.Effects of 2-mercaptoethanol and buthionine sulfoximine on cystine metabolism by and proliferation of mitogen-stimulated human and mouse lymphocytes[J].International Journal of Immunopharmacology,1992,14(7):1221-1234

[4]徐海军,黄瑞林,李铁军,等.半胱胺的营养生理效应[J].饲料研究,2009 (9):24-26

[5]Jeitner T M,Delikatny E J,Bartier W A,et al.Inhibition of drug-naive and-resistant leukemia cell proliferation by low molecular weight thiols[J].Biochemical Pharmacology,1998,55(6):793-802

[6]Jeitner T M,Lawrence D A.Mechanisms for the cytotoxicity of cysteamine[J].Toxicological Sciences,2001,63(1):57-64

[7]史明雷,柯连坤,赵茹茜,等.岭南黄羽肉种鸡饲喂半胱胺对后代肉鸡抗氧化功能的影响[J].中国畜牧杂志,2013,49(17):43-48

[8]徐瑞雪,李建亮,李同树.日粮中添加半胱胺对肉鸡血浆中抗氧化指标的影响[J].家畜生态学报,2006,26(6):13-16

[9]何军,沈赞明,杨倩.半胱胺盐酸盐对断奶羔山羊小肠黏膜生长的影响及其抗氧化作用[J].中国兽医学报,2008,27(6):887-892

[10]刘华忠,钟杰平.半胱胺对小鼠抗氧化能力的影响[J].河南科技大学学报:自然科学版,2009,30(1):65-68

[11]Takahashi M,Nagai T,Hamano S,et al.Effect of cysteamine on in vitro development and intracellular glutathione content of bovine embryos[J].Theriogenology,1993,39(1):326

[12]Perry G,Moreira P I,Siedlak S L,et al.Natural oxidant balance in Parkinson disease[J].Archives of neurology,2009,66(12):1445-1445

[13]Rao L,Puschner B,Prolla T A.Gene expression profiling of low selenium status in the mouse intestine:transcriptional activation of genes linked to DNA damage,cell cycle control and oxidative stress[J].The Journal of Nutrition,2001,131(12):3175-3181

[14]曹利.半胱胺对手术山羊外周血T 淋巴细胞作用的研究及其抗氧化作用初探[D].南京：南京农业大学,2008

[15]Chan B P.Use of cysteamine in treating Parkinson's disease:U.S.Patent Application 13/311,098[P].2011-12-5

[16]王海梅.半胱胺对机体抗氧化能力及血红蛋白含量、铁利用的影响研究[D].无锡：江南大学,2006

[17]Takagi Y,Shikita M,Terasima T,et al.Specificity of radioprotective and cytotoxic effects of cysteamine in HeLa S3 cells:Generation of peroxide as the mechanism of paradoxical toxicity[J].Radiation Research,1974,60(2):292-301

[18]Gentile V,Cooper A J L.Transglutaminases-possible drug targets in human diseases[J].Current Drug Targets-CNS & Neurological Disorders,2004,3(2):99-104

[19]Barnouin J,Chassagne M.Predictive variables for the occurrence of early clinical mastitis in primiparous Holstein cows under field conditions in France[J].The Canadian Veterinary Journal,2001,42(1):47

[20]Heinrichs A J,Costello S S,Jones C M.Control of heifer mastitis by nutrition[J].Veterinary Microbiology,2009,134(1):172-176

[21]沈赞明,张荣飞,解红梅,等.半胱胺盐酸盐对泌乳20～42 周奶牛产奶性能和部分免疫指标的影响[J].畜牧兽医学报,2005,36(7):667-673

[22]Bryant H U,Holaday J W,Bernton E W.Cysteamine produces dose-related bidirectional immunomodulatory effects in mice[J].Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics,1989,249(2):424-429

[23]杨彩梅,陈安国.半胱胺对肉用仔鸡生长性能和内脏器官的影响[J].中国畜牧杂志,2002,38(6):16-17

[24]徐雪松,吴金节,李健,等.半胱胺对仔猪生长性能及小肠内容物消化酶活性的影响[J].中国兽医学报,2008,28(9):1088-1091

(责任编辑李辛)

收稿日期：2014-04-16；修回日期：2014-05-04

基金项目：农产品质量安全监管(饲料)项目“反刍动物饲料安全评价”；中国农业科学院科技创新工程(ASTIP-IAS07)；动物营养学国家重点实验室自主课题(2004DA125184G1103).

通信作者：王加启，男，研究员，博士生导师，主要从事奶牛营养与饲料、牛奶质量形成和奶产品安全评估的研究.E-mail：wang-jia-qi@263.net

中图分类号：S 816.7

文献标志码：A

文章编号：1003-4315(2015)03-0016-07