HCN4与心脏生物起搏研究进展

杨一晨 沈法荣 何浪

HCN4与心脏生物起搏研究进展

杨一晨 沈法荣 何浪

HCN4作为超极化激活环核苷酸门控阳离子通道（HCN）基因家族在心脏中表达的主要亚型，负责编码产生起搏电流，被称为起搏基因。近年来，利用病毒载体转染HCN4基因来构建心脏生物起搏器取得了较大进展，但目前尚局限于动物实验阶段，其应用于临床实践还有很多问题需要研究解决。现将HCN4与心脏生物起搏研究进展作一综述。

1 HCN4概述

正常心脏兴奋起源于窦房结，并经结间束传导至房室结，通过房室结纤维，经房室束、左右束支，最终传导至心室浦肯野纤维。1976年，Noma等[1]首次在兔心脏窦房结组织记录到一种特殊的电流，其在膜超极化时被激活，称之为特种离子流（If）。1980年，Brown等[2]在窦房结起搏活动研究中发现这一电流是超极化激活的内向阳离子电流，且尚具有钠钾离子通透、细胞内环核苷酸（cAMP）调节、微弱的单通道导电及被细胞外铯特异性阻断等特性，称之为超极化激活的阳离子电流（Ih），介导Ih的离子通道，即称之为HCN，是Ih/If形成的分子基础。HCN家族的基因产物包括HCN1～4四个成员。在哺乳动物的心脏组织中4种基因亚型均被发现[3]，其中主要为HCN1、HCN2和HCN4，而窦房结中分布最为广泛的是HCN4，HCN3则主要分布于神经纤维上[4]。早在十余年前就有多项研究发现兔、鼠、狗窦房结上HCN4有显著的表达[4-7]。其后，又有多个研究表明人窦房结组织中亦主要表达HCN4[8-9]。因此，目前认为HCN通道属于电压门控阳离子通道家族成员，负责编码产生If电流，而HCN4是其中在心脏窦房结细胞中表达最高的亚型。

2 HCN4与心脏起搏的关系

窦房结是心脏的起搏点，而窦房结中分布最多的是HCN4亚型，那么HCN4在心脏起搏活动中究竟发挥了怎样的作用呢？早在1999年就有Shi等[4]用RNA酶保护试验的方法探测到HCN4基因为兔窦房结中If离子流通道的主要编码基因（占全部HCN亚型的80%以上），表明心脏起搏活动主要由HCN4产生。2003年，Stieber等[10]进行了一项基因剔除研究，结果表明，HCN4基因全部缺失的小鼠由于不能形成“成熟”的起搏动作电位而不能存活，而部分缺失的小鼠心脏窦房结的自发搏动频率显著下降超过50%。临床方面，Schulze-Bahr等[11]研究了1例先天性窦房结功能紊乱的患者，发现该患者的HCN4基因中1个碱基缺失，将该突变的HCN4基因转染COS-7细胞（SV40病毒基因转化的非洲绿猴肾细胞）后发现，其产生的If样离子电流对cAMP不敏感，提示突变的HCN4基因虽然可以表达，但其生物物理特性已经改变，这可能是导致患者窦房结功能紊乱的原因。类似的临床研究均表明HCN4突变的患者表现出了自发性窦房结功能失常[12-14]。这说明，HCN4基因在窦房结起搏细胞的自发电活动中起着主要的作用。在基础实验方面，国内学者检测到HCN4基因修饰的大鼠间充质干细胞具有窦房结细胞类似的动作电位，成功获得了心脏起搏样细胞[15]。上述研究均表明，HCN4是起搏基因，心脏起搏电流的产生和调控主要依赖于HCN4基因。

3 HCN4构建生物起搏的相关研究

目前永久性人工心脏起搏器已广泛应用于临床，但是起搏器植入仍存在一定比例的气胸、导线脱位、心肌穿孔、囊袋感染等风险，同时面临着起搏器寿命有限而需多次更换、原导线拔除、新导线植入等一系列问题。因此寻求更加符合人体需要的生物起搏器以修复窦房结或者重建心脏的起搏功能，从而替代电子起搏器，已成为当前研究的热点之一。生物起搏是指应用细胞分子生物学及相关技术对受损节律点或特殊传导系统细胞进行修复或替代，使心脏起搏和传导功能得以恢复。生物起搏主要包括细胞起搏和基因起搏。细胞起搏就是利用干细胞的高度自我更新和多向分化潜能这种生物特性，将其移植到受体心脏起搏点或传导障碍的部位使之分化为起搏细胞，最终恢复心脏的起搏和传导功能。基因起搏是应用基因工程、细胞生物学技术及心肌生物电产生机制，对受损的自律性细胞或发生传导障碍的特殊传导系统的细胞进行基因修复、替换和基因产物的补充或阻断，以期通过导入基因的表达，补充缺乏的（或失去正常功能的）蛋白质，使心脏的起搏和传导功能得以恢复。本文着重谈HCN4基因起搏。

HCN4基因被认为是引起心脏电活动的起搏基因，目前国内外研究者已做过不少相关研究来探讨HCN4基因构建生物起搏器的可行性。2006年，李继文等[16]成功构建了HCN4重组腺病毒载体，感染COS-7细胞，并通过膜片钳技术在转基因细胞中检测到超极化激活的非选择性内向阳离子电流If，证实了HCN4基因的表达加强能增加起搏离子流If。Zhong等[17]通过注射HCN4腺病毒载体至大鼠左心室壁，通过刺激迷走神经造成窦性停搏，产生的室性异位起搏心律其节律达到了生理需求。仝识非等[18]发现HCN4基因修饰的大鼠间充质干细胞（MSCs）有超极化激活的内向电流，且该电流具有明显的时间及电压依赖特性，受cAMP调控，成功获得起搏样细胞。一项在体实验中，Cai等[19]在猪心室肌细胞注射转染HCN4的腺病毒，房室结经射频导管消融形成完全性房室传导阻滞，注射3～4d后发现猪心室率加快，且心率受异丙肾上腺素调控，经转染的心室肌细胞存在If电流，该研究表明：对于缓慢性心律失常的基因治疗，应用HCN4高表达的腺病毒载体是可行的。在此基础上，Boink等[20]将HCN4基因通过慢病毒载体转入幼鼠的心室肌细胞，通过膜片钳检测发现转染HCN4心室肌细胞的If起搏电流较未转染HCN4心室肌细胞高出10倍以上，并且出现窦房结细胞样的舒张期缓慢去极化。类似还有研究发现阳性转染HCN4的细胞中记录到的If电流对低浓度铯敏感[21]。近年来一项将HCN4基因修饰的大鼠MSCs与乳鼠心肌细胞共培养的实验发现，乳鼠心肌的自发搏动频率明显增高，且两者间建立了有效的电机械连接，为进一步行生物起搏治疗提供了实验依据[22]。以上所述的这些研究均表明：通过HCN4基因导入，离体或在体局部高表达HCN4能形成自发的起搏，且该通道与生理性起搏离子流通道具有相同的动力学特性，为建立新型有效的细胞生物起搏技术奠定了实验基础。

4 HCN4构建生物起搏的局限性

以上所述的实验证实了通过起搏基因HCN4转染种子细胞构建心脏生物起搏器的可行性。然而，这类研究具有不可忽视的局限性。例如，通过这些方法构建的生物起搏器，其形成的起搏心律的持续性没有得到证实，在持久性、稳定性方面还远远比不上电子起搏器，因为基因的表达可能消失，并且相关的在体研究最长持续时间不到1个月[23]。使用病毒作为载体同样也存在着问题。安全性好的腺病毒载体不能持久且表现出一定的过敏反应，持久性好的逆转录病毒载体则有生成赘生物的危险。一种避免使用病毒媒介的方法是使用细胞移植的治疗方法[24]，细胞被种植入心脏作为心脏起搏器的功能团块，然而，在细胞选择、细胞分化、精确定位、转移至宿主心肌的整合、免疫排斥等方面也存在着不少问题和挑战。目前此类研究中应用较多的慢病毒载体进行转染，在基因的持久表达上是不错的选择，但它们在体内的安全性仍有待于进一步证明。再者，目的基因随机整合有可能导致正常细胞周期及抑癌基因的破坏，引起严重后果，因此基因转染后还须评估插入位点，确保目的基因准确克隆。并且由于窦房结细胞的起搏功能是多种机制共同参与完成的，因此进一步阐明窦房结细胞的电生理特性有助于研发实用性更高、功能更加完善的生物起搏器。综上所述，生物起搏目前仍局限于基础实验阶段，暂时不具有临床上的可行性。

5 结语

HCN4作为超极化激活环核苷酸门控阳离子通道基因家族亚型，被认为是心脏起搏细胞产生自动节律的重要基础，其中If是重要的起搏调控部分。HCN家族基因参与编码If电流，由于HCN4与心脏起搏的产生和调节关系密切，所以被称为起搏基因，具有调控起搏的功能。近年来国内外对该基因的结构功能以及与心脏生物起搏关系的研究不断深入，以HCN4为目的基因，将慢病毒、腺病毒、质粒、脂质体等作为载体，重组后感染胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞等多潜能干细胞，使之分化为具有起搏功能的细胞，或是在载体携带下直接注射入动物体内，用于构建心脏生物起搏器。此类研究已取得较大进展。但是目前生物起搏尚处于基础研究阶段，应用于临床前需要解决很多问题：例如病毒媒介存在的安全问题和遗传突变的可能；生物起搏器的有效性、持续性和稳定性，可能被心脏疾病进程影响；基因导入的准确性；宿主的免疫反应等问题。因此要构建真正类似正常起搏的生物起搏器需要更加深入的研究和探讨。尽管生物起搏目前还存在诸多问题和挑战，但是它向世人展示出了无穷的魅力和前景，可能成为临床上继电子起搏器之后治疗缓慢性心律失常的新技术。目前学者们已将它作为心脏生物起搏领域的主要方向之一，相信不断地深入研究，可使该领域的研究成果能早日应用于临床当中。

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2014-07-18）

（本文编辑：杨丽）

310053浙江中医药大学第二临床医学院，浙江绿城心血管病医院心脏中心（沈法荣、何浪）

沈法荣，E-mail：shenfarong2011@163.com