乳腺癌外周血cfDNA ErbB-2启动子区甲基化状态及与肿瘤Her-2表达的关系

梁　骁，　郭　萌，　宋文哲，　李　莹，　祝志强

作者单位： 221006　江苏　徐州，徐州医学院附属医院　甲乳外科

第一作者： 梁　骁，男，硕士研究生，主治医师，研究方向：甲状腺和乳腺肿瘤的临床及基础研究，E-mail:liangxiao@live.com

乳腺癌外周血cfDNA ErbB-2启动子区甲基化状态及与肿瘤Her-2表达的关系

梁骁，郭萌，宋文哲，李莹，祝志强

作者单位： 221006江苏徐州，徐州医学院附属医院甲乳外科

第一作者： 梁骁，男，硕士研究生，主治医师，研究方向：甲状腺和乳腺肿瘤的临床及基础研究，E-mail:liangxiao@live.com

【摘要】目的探讨非转移乳腺癌患者外周血中游离无细胞的DNA(cfDNA)中ErbB-2基因启动子区5’CpG甲基化状态及其与肿瘤组织中Her-2表达的关系。方法分离非转移乳腺癌患者外周血中的cfDNA，利用重亚硫酸盐测序法(BSP)对分离出的cfDNA及外周血细胞DNA的ErbB-2基因启动子区进行5’CpG甲基化分析，免疫组化及FISH方法检测肿瘤组织中Her-2的表达情况。结果ErbB-2基因启动子区5’CpG的甲基化只在乳腺癌患者的血浆cfDNA中检测到(19/40)，在其对应的外周血血细胞中未发现；乳腺癌患者外周血cfDNA的ErbB-2基因启动子区5’CpG甲基化和其肿瘤组织Her-2的表达成负相关。结论乳腺癌患者外周血cfDNA ErbB-2启动子区5’CpG的甲基化状态与肿瘤组织Her-2表达呈负相关。提示外周血cfDNA ErbB-2启动子区5’CpG甲基化状态能从某种程度上反映乳腺癌患者肿瘤组织Her-2表达情况，有可能作为乳腺癌Her-2状态观察的新窗口，可用于帮助乳腺癌分子分型判断，是否能作为乳腺癌治疗的新靶点，并作为Her-2阳性患者早期诊断的指标，尚有待于进一步研究。

【关键词】乳腺癌；BSP；Her-2；ErbB-2；cfDNA；甲基化

cfDNA ErbB-2 promoter methylation status in peripheral blood of non-metastatic breast cancer patients and its relationship with Her-2 expression in tumor tissueLIANGXiao,GUOMeng,SONGWenzhe，LIYin,ZHUZhiqiang.(DepartmentofBreastandThyroid,TheAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege，Xuzhou221000，China)

Correspondingauthor:GUOMeng,E-mail:guomeng62@126.com

Abstract：ObjectiveTo investigate the relationship of methylation of ErbB-2 gene 5’CpG of cfDNA in peripheral blood of non-metastatic breast cancer patients with expression of Her-2 in tumor tissue.MethodsIsolate cell-free DNA in peripheral blood of non-metastatic breast cancer patients, analysis methylation of 5’CpG in ErbB-2 gene promoter using bisulfite-sequencing PCR (BSP), detect the expression of Her-2 using immunohistochemistry and FISH.ResultsMethylation of ErbB-2 gene promoter was only detected in plasma cfDNA of breast cancer patients (19/40), not found in the corresponding peripheral blood cells; Methylation of ErbB-2 gene 5’CpG of cfDNA in peripheral blood of breast cancer patients was negatively correlated with the expression of Her-2 in tumor tissue.ConclusionsMethylation of ErbB-2 gene 5’CpG in peripheral blood of breast cancer patients was negatively correlated with the expression of Her-2 in tumor tissue. We can speculate that the methylation of ErbB-2 gene 5’CpG in peripheral blood of breast cancer patients can reflect the expression of Her-2 breast cancer tissues to some extent, which may be used as a new method to observe Her-2 status of breast cancer, and which also can be used to help determine the molecular typing of breast cancer, and used as a new target for breast cancer treatment, and as an early diagnosis indicator of Her-2 positive patients still needs further study.

Keywords：breast cancer;BSP;Her-2;ErbB-2;CfDNA;methylation

基于Her-2及雌、孕激素等指标的乳腺癌的分子分型是乳腺癌分类的重要依据，不同的分子分型在判断乳腺癌的自然转归、治疗方案的选择、治疗的敏感性及预后的判断上均有不同的特点。Her-2高表达的乳腺癌患者预后相对较差，针对Her-2阳性患者的分子靶向治疗如曲妥珠单抗效果显著，Her-2状态也影响肿瘤对内分泌治疗及化疗等综合治疗的反应[1]。DNA甲基化作为表观遗传学的重要概念，在机体生理状态及肿瘤发生发展中起重要作用[2-3]。外周血是人体宏观系统的一个指示窗口，游离DNA(cfDNA)检测具有方便、相对无创、可重复等优点。已有文献证实外周血DNA甲基化状态的变化与肿瘤组织甲基化状态的变化类似，均与肿瘤的分子特点具有相关性[4]。本课题探讨非转移乳腺癌患者外周血cfDNA ErbB-2启动子区5’CpG甲基化状态及其与肿瘤组织Her-2表达的关系，以探索乳腺癌治疗新的靶点。

1材料与方法

1.1研究对象

徐州医学院附属医院2014年非转移乳腺癌患者40例(研究组)及非乳腺癌患者20例(对照组)。

1.2免疫组化及FISH(fluorescent in situ hybridization，荧光原位杂交)检测肿瘤组织Her-2蛋白表达和Her-2基因扩增

用多聚甲醛将乳腺癌组织固定过夜，经石蜡包埋，5μm切片，伊红苏木精染色确认为乳腺癌组织。免疫组化检测ErbB-2蛋白表达：光镜观察，阳性反应物为棕黄色颗粒，定位于细胞质中。高倍显微镜下观察10个视野：没有染色或<30%肿瘤细胞染色为阴性(-)；>30%的肿瘤细胞有不完整胞质着色为弱阳性(+)；>30%的肿瘤细胞有较弱但完整的胞质着色为阳性(++)；>30%的肿瘤细胞较强完整胞质着色为强阳性(+++)。(-)与(+)定义为Her-2阴性，(+++)定义为Her-2阳性，(++)者进行FISH检测：切片经常规脱蜡、水化，酸性亚硫酸钠处理，胃蛋白酶消化，HCl浸泡，脱水，丙酮固定，50 ℃烘片15 min，加探针工作液于组织切片上，60 ℃变性10 min，40 ℃湿盒杂交过夜，第二天漂洗，避光干燥玻片，DAPI复染后封片。结果判定：计数30个细胞，统计Ratio值(Ratio值=30个细胞核中红荧光总数/30个细胞核中绿荧光信号总数)。Ratio<1.8为阴性结果，提示该样本无Her-2基因扩增；Ratio>2.2为阳性结果，提示样本中Her-2基因发生扩增(Ratio在2.3～4.0提示低水平扩增，4.1～10提示中水平扩增，>10提示高水平扩增)；Ratio在1.8～2.2之间时，选择增加计数细胞至100个，或重做FISH来判定最终结果。

1.3外周血浆cfDNA和血细胞DNA的提取和亚硫酸盐修饰

患者采血5 ml置于乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)处理后的抗凝管中，正常对照人群需采血量10 ml。采血过程如果发生溶血，样品应该弃用。采血后1 h内完成血浆cfDNA分离,抗凝血先用800 g离心10 min，取出上清后将该上清再用1 600 g离心10 min，取用上清进行cfDNA抽提，第一次离心后的血细胞进行血细胞DNA的抽提。分别采用QIAamp DNA mini Kit和QIAamp Blood Mini Kit(德国Qiagen公司产品)抽提血浆中的DNA。所获得的DNA置于-20 ℃保存。采用EpiTect 96 Bisulfate Kit(德国Qiagen公司产品)对DNA进行亚硫酸轻盐修饰。纯化后的DNA加入15 μl去离子水溶解。如前所述，这种亚硫酸盐处理后的DNA可以作为BSP扩增的模板进行ErbB-2启动区表型遗传状态的分析。

1.4BSP分析血浆cfDNA中ErbB-2基因启动区5’CpG表型遗传状态及外周血血细胞中ErbB-2基因启动子区5’CpG甲基化状态

ErbB-2基因启动子区CpG岛经过重亚硫酸盐转化后，未甲基化的胞嘧啶被修饰为U，而甲基化的胞嘧啶则不发生此种转化，通过聚合酶链式反应扩增该CpG岛后进行测序分析就可以了解不同样品中ErbB-2基因启动子区域甲基化的差异。ErbB-2基因启动子区域BSP的上游引物为：5’TGGGGTTTATTTGTTAGATTTA 3’，下游引物为：5’CCTCAAAAAAAATCATAAAAAA 3’，扩增的ErbB-2基因启动区域大小为456 bp。该区域含有32个CG位点。采用TAKARA聚合酶链式反应扩增试剂进行扩增，PCR的反应体系为30 μl，包括修饰后的DNA样品2 μl，TAQ酶0.15 μl。PCR扩增的条件为：第一步，94 ℃预变性5 min；第二步，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共进行40个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR结束后行2.0%的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，回收大小符合预期的目标片段，进行TA克隆，T载体选用宝生物的pMD19T，将目标PCR产物和载体连接后转化大肠杆菌top10感受态细胞后涂氨苄抗性平板，第二天菌落鉴定，将阳性克隆接种的氨苄抗性的液体培养基中，37 ℃摇床过夜培养后，送上海杰里生物科技有限公司测序。

1.5统计分析

对得到的血浆cfDNA ErbB-2启动子区5’CpG甲基化状态与肿瘤组织Her-2表达两组数据，采用SPSS19.0统计软件，进行卡方检验及Pearson相关分析，P<0.05认为差异有统计学意义。

2结果

2.1病例信息分析

40例乳腺癌患者的平均年龄53.7岁(SD 10.5)；初潮年龄平均14岁(SD 1.5)；绝经前占60%，绝经后占40%；初次生育时间平均24岁(SD 4.3)；85%哺乳，15%未哺乳。患者病理学特征见表1。

表1　乳腺癌患者病理学特征

2.2癌组织中Her-2表达分析(免疫组化及FISH)

40例乳腺癌患者中Her-2阳性11例，Her-2阴性29例。图1～2为免疫组化阳性与阴性图，图3～4为FISH阳性与阴性图。

图1　免疫组化(+++)　　　　　　图2　免疫组化(-)　　　　　　　　图3　FISH阳性　　　　　　　图4　FISH阴性

2.3外周血中ErbB-2基因启动子区5’CpG甲基化状态分析40例乳腺癌患者的外周血中，有19例的血浆cfDNA中检测到了ErbB-2基因启动子区5’CpG的甲基化(19/40)(见图5)，但其对应的外周血细胞DNA中未发现该基因的甲基化(见图6)。在选用的正常对照样品中无论是血浆cfDNA还是血细胞DNA中均未检测到ErbB-2基因启动子区5’CpG的甲基化(见图7～8)。19例能检测到ErbB-2启动子区5’CpG甲基化的患者中有18例的组织中Her-2表达呈阴性(见表2)。

图5　乳癌患者血浆cfDNA

图6　乳癌患者血细胞DNA

表2　血浆cfDNA ErbB-2基因启动子区5’CpG甲基化状态与

应用卡方检验患者血浆cfDNA ErbB-2启动子区5’CpG甲基化状态与肿瘤组织Her-2表达的关系，χ2=8.976，P=0.003，说明两者之间的差异有统计学意义。进一步行pearson相关性分析，R=-0.474，P=0.002，两者之间存在负相关。

3讨论

甲基化是表观遗传学的重要概念。DNA甲基化对正常细胞的分化[5]，基因印记的维持[6]，X染色体的失活[7]，基因转录抑制[8]等均起着重要作用；在恶性肿瘤的发生发展中DNA甲基化的作用也已被证实[2-3]。健康细胞的抑癌基因启动子区甲基化程度低或处于非甲基化状态，使得抑癌基因能不断表达并发挥其正常功能从而抑制肿瘤，而肿瘤细胞的抑癌基因启动子区往往发生甲基化导致受其调控的基因表达减弱或被关闭[9]；反过来，有研究提示，在健康的细胞中高度甲基化的区域如果其甲基化水平降低，被这些区域调控的癌基因将被激活，最后也会导致肿瘤的发生[10]。

目前，外周血中存在的游离DNA(cfDNA)引起了肿瘤学界的极大关注。大量的研究表明外周血中游离的肿瘤相关基因的异常甲基化状态，与其对应的肿瘤组织相应基因的异常甲基化状态具有一定的相关性，使得检测外周血中游离DNA的甲基化状态有望成为新的病理诊断的窗口。cfDNA一般情况下来源于凋亡的造血细胞，而肿瘤患者较非肿瘤患者的外周血中含有更高浓度的cfDNA，可能与肿瘤细胞等释放大量DNA入血有关。cfDNA检测对恶性肿瘤的筛查、预后判断与疗效检测等均有重要意义[4]。有实验表明，cfDNA中ITIH5等抑癌基因甲基化的改变可作为乳腺癌筛查的指标[11]。

Her-2阳性乳腺癌具有恶性程度高，易转移，易复发等特点。2005年的St. Gallen国际乳腺癌治疗专家共识将Her-2列为重要的单项风险因素，乳腺癌患者的Her-2状态，包括蛋白表达及基因扩增情况，是评估患者预后的重要因素[1]。有研究发现，乳腺癌患者肿瘤组织中EerbB-2启动子区5’CpG的甲基化明显高于癌旁组织[12]，提示ErbB-2基因启动子区5’CpG的甲基化导致其表达受抑是乳腺癌发生发展的一个重要因素。在本次实验中我们选用了BSP的方法，相比使用最多的MSP，此方法涵盖的CpG区域更大。我们的这次研究中选用的该基因的启动子区至少包含了22个CpG位点。

本研究显示，乳腺癌患者外周血cfDNA ErbB-2启动子区5’CpG甲基化状态与肿瘤组织Her-2表达呈负相关(R=-0.474，P=0.002)。提示：外周血cfDNA ErbB-2启动子区5’CpG甲基化状态能反映乳腺癌患者肿瘤组织Her-2表达状况，可作为乳腺癌Her-2状态观察的新窗口，用于乳腺癌分子分型判断，或可成为乳腺癌治疗的新靶点，并作为Her-2阳性患者早期诊断的指标。为避免干扰因素，本实验亦对外周血血细胞DNA中ErbB-2启动子区5’CpG甲基化状态进行了分析，结果显示，研究组及对照组外周血血细胞DNA的ErbB-2启动子5’CpG区均未检测到甲基化，排除了外周血细胞对本实验的干扰，增加了实验数据的可靠性。

乳腺癌患者外周血cfDNA ErbB-2启动子区5’CpG甲基化状态与肿瘤组织Her-2表达呈负相关。提示外周血cfDNA ErbB-2启动子区5’CpG甲基化状态能从某种程度上反映乳腺癌患者癌组织Her-2表达情况，有可能作为乳腺癌Her-2状态观察的新窗口，可用于帮助乳腺癌分子分型判断，是否能作为乳腺癌治疗的新靶点、并作为Her-2阳性患者早期诊断的指标，尚有待于进一步研究。

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论著

[收稿日期：2015-02-06][本文编辑：戴雅玥]

文章编号：1674-4136(2015)04-0212-05

doi：10.3969/j.issn.1674-4136.2015.04.003

通讯作者：郭萌，男，本科，副主任医师，专业特长：甲状腺和乳腺肿瘤的诊断与治疗，E-mail:guomeng62@126.com